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Jun 26, 2023

Efecto antibacteriano sinérgico de nanopartículas de cobre y plata y su mecanismo de acción.

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 9202 (2023) Citar este artículo 1046 Accesos 1 Citas Detalles de métricas Las infecciones bacterianas son una de las principales causas de muerte en todo el mundo. En el caso

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 9202 (2023) Citar este artículo

1046 Accesos

1 Citas

Detalles de métricas

Las infecciones bacterianas son una de las principales causas de muerte en todo el mundo. En el caso de infecciones bacterianas tópicas, como infecciones de heridas, la plata (Ag) ha sido históricamente uno de los antibacterianos más utilizados. Sin embargo, las publicaciones científicas han demostrado los efectos adversos de la plata sobre las células humanas, la ecotoxicidad y un efecto antibacteriano insuficiente para la eliminación completa de las infecciones bacterianas. El uso de Ag en forma de nanopartículas (NP, 1-100 nm) permite controlar la liberación de iones de Ag antibacterianos pero aún no es suficiente para eliminar la infección y evitar la citotoxicidad. En este estudio, probamos la potencia de las NP de óxido de cobre (CuO) funcionalizadas de manera diferente para mejorar las propiedades antibacterianas de las NP de Ag. Se estudió el efecto antibacteriano de la mezcla de NP de CuO (NP de CuO, CuO –NH2 y CuO –COOH) con NP de Ag (recubiertas y sin recubrir). Las combinaciones de CuO y Ag NP fueron más eficaces que Cu o Ag (NP) solos contra una amplia gama de bacterias, incluidas cepas resistentes a los antibióticos como Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa gramnegativas, así como Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis y Enterococcus faecalis grampositivos. Streptococcus disgalactiae. Demostramos que las NP de CuO cargadas positivamente mejoraron el efecto antibacteriano de las NP de Ag hasta 6 veces. En particular, en comparación con la sinergia de las NP de CuO y Ag, la sinergia de los respectivos iones metálicos fue baja, lo que sugiere que se requiere la superficie de NP para mejorar el efecto antibacteriano. También estudiamos los mecanismos de sinergia y demostramos que la producción de iones Cu+, la disolución más rápida de Ag+ de las NP de Ag y la menor unión de Ag+ por las proteínas de los medios de incubación en presencia de Cu2+ fueron los principales mecanismos de sinergia. En resumen, las combinaciones de CuO y Ag NP permitieron aumentar el efecto antibacteriano hasta 6 veces. Por lo tanto, el uso de combinaciones de CuO y Ag NP permite conservar excelentes efectos antibacterianos debido a Ag y sinergia y mejora los efectos beneficiosos, ya que Cu es un microelemento vital para las células humanas. Por lo tanto, sugerimos usar combinaciones de NP de Ag y CuO en materiales antibacterianos, como productos para el cuidado de heridas, para aumentar el efecto antibacteriano de Ag, mejorar la seguridad y prevenir y curar infecciones bacterianas tópicas.

El desarrollo de nuevos antibacterianos es una de las principales prioridades señaladas por la Organización Mundial de la Salud y la comunidad científica1. Un metaanálisis reciente mostró que hubo 4,95 millones de muertes asociadas con la resistencia a los antibióticos en 2019 y destacó la necesidad de tomar medidas urgentes para abordar las infecciones bacterianas resistentes a los antibióticos2. La infección de heridas es un tipo de infección crónica que puede tener consecuencias graves, como la amputación de una extremidad y, si no se trata, la muerte. En 15 a 27% de los casos, la infección bacteriana de la herida provoca gangrena que requiere la amputación de la extremidad3, lo que demuestra que las estrategias actuales de manejo de la infección de la herida son ineficientes y se necesitan mejores enfoques.

En el campo de los antibióticos tradicionales, el concepto sinérgico combinatorio se considera actualmente como uno de los enfoques más prometedores para tratar infecciones bacterianas y evitar resistencias4. La combinación de diversos fármacos permite reducir la dosis de los fármacos y, por tanto, provoca menos efectos secundarios en comparación con la monoterapia5.

Sin embargo, los antibióticos se administran por vía sistémica y sus combinaciones plantean perfiles farmacocinéticos impredecibles. Las combinaciones de NP aplicadas tópicamente evitarían estos inconvenientes de los antibióticos sistémicos. Por tanto, consideramos muy prometedora la aplicación de NP sinérgicas. Nuestra hipótesis es que, debido a los diferentes modos de acción sobre las bacterias, las NP de Cu y Ag tienen una mayor eficacia antibacteriana cuando se aplican juntas, mientras que el Cu mejora la eficacia antibacteriana de las NP de Ag, los mejores antibacterianos a base de metales conocidos hasta ahora. Además, el Cu es un microelemento y es beneficioso para la cicatrización de heridas, estimulando la migración de fibroblastos, promoviendo la síntesis de colágeno, siendo esencial para la angiogénesis, apoyando la cicatrización de heridas6 y la regeneración ósea7. Así, las combinaciones de Cu y Ag NP podrían tener un efecto antibacteriano superior, mejorar la cicatrización de heridas y, por tanto, ser un tratamiento altamente beneficioso para las heridas infectadas.

Por otra parte, los efectos antibacterianos de las NP de CuO y Ag están bien estudiados. Utilizando las palabras clave “nanopartículas de plata* bacterias*” o “nanopartículas de cobre* bacterias*”, la búsqueda en PubMed® realizada el 23 de marzo de 2023 obtuvo 6.558 y 1.113 respuestas, respectivamente.

Los mecanismos antibacterianos de las Ag NP per se se conocen relativamente bien. Cuando entran en contacto con bacterias, las Ag NP se localizan en la pared celular bacteriana y se oxidan, lo que lleva a la liberación concentrada de Ag en la interfaz NP-célula. Anteriormente demostramos que el daño a la pared celular de las bacterias gramnegativas por las Ag NP ocurre principalmente en la membrana plasmática, mientras que la membrana externa de la célula bacteriana no era el objetivo de las NP9.

Los mecanismos moleculares de las NP de CuO están menos estudiados. En 2008, Heinlaan et al. demostraron que la toxicidad de las NP de CuO (CE50 = 79 mg/l) para las bacterias Vibrio fischeri pero también para los crustáceos se debía a los iones de Cu solubilizados10. En particular, a pesar de sus excelentes efectos antibacterianos, la toxicidad del CuO para las células humanas es menor en comparación con la toxicidad de Ag y Ag NP. Dado que el Cu es un microelemento vital, en algunos casos las NP de CuO facilitan efectos positivos como una mejor angiogénesis y cicatrización de heridas6. Se estudiaron más a fondo los mecanismos antibacterianos detallados de las NP de CuO utilizando E. coli recombinante11. A diferencia de las NP de Ag que no causaron especies reactivas de oxígeno (ROS) en condiciones abióticas, las NP de CuO, especialmente las cargadas positivamente, indujeron niveles significativos de ROS. La carga superficial de las NP se puede modificar fácilmente mediante la funcionalización de la superficie y desempeña un papel en la inactivación de bacterias. Dado que la pared celular de las bacterias está cargada negativamente, las NP cargadas positivamente pueden adherirse mejor a las paredes celulares bacterianas e inactivar las bacterias de manera más eficiente.

Hemos estudiado las NP antibacterianas desde 2008 con el objetivo de comprender los mecanismos de toxicidad de las NP y aumentar su eficacia y seguridad1,8,9,10,12,13,14. Artículos recientes y nuestra investigación demostraron que el efecto antibacteriano de las NP puede mejorarse significativamente si se usan en combinación NP a base de metales o los metales respectivos. Sin embargo, casi todos los trabajos publicados anteriormente se centran en los efectos combinados de los iones metálicos y no de las NP15,16,17,18. Entre varias combinaciones de metales estudiadas (Ag con Cu, Zn, Co, Cd y Ni), la combinación de Ag y Cu tuvo el mayor efecto antibacteriano sinérgico contra bacterias Gram negativas y Gram positivas19. Existe un interés creciente en la sinergia entre Cu y Ag que se manifiesta en más artículos publicados en los últimos años. La mayoría de ellos describieron las propiedades antibacterianas de las nanoaleaciones de Cu/Ag20,21 o Cu/Ag con la adición de algunos otros metales, por ejemplo tungsteno22. Además, Jang y otros. mostró perfectas propiedades antibacterianas, antibiopelícula y cicatrización de heridas de los compuestos de Cu/Ag/óxido de grafeno en un modelo de ratón con heridas infectadas23. Sorprendentemente, a pesar de estos artículos que describen la sinergia antibacteriana entre Cu y Ag, no identificamos ninguna publicación que estudiara sistemáticamente el efecto sinérgico de las combinaciones de NP o sus mecanismos.

En este estudio planteamos la hipótesis de que el mecanismo antibacteriano sinérgico de las NP de CuO y Ag está impulsado por sus mecanismos de acción complementarios: las NP de Ag dañan las paredes celulares bacterianas, facilitando la entrada de las NP de CuO en las bacterias, donde las NP de CuO alteran las moléculas intracelulares. Más específicamente, describimos por primera vez el efecto antibacteriano sinérgico entre las NP de Ag y CuO con diferentes grupos funcionales contra varias bacterias, incluidas las bacterias multirresistentes. En segundo lugar, realizamos una serie de pruebas para comprender los mecanismos de la sinergia antibacteriana de las NP: medimos el daño de la membrana externa, la inducción de ROS, la biodisponibilidad de los iones Cu y Ag y la transformación de carga del ion Cu.

La caracterización de las NP utilizadas en este estudio se muestra en la Tabla 1. Las NP de CuO (CuO) y el CuO funcionalizado con grupos amino (CuO-NH2) tuvieron potencial zeta positivo, el CuO funcionalizado con grupos carboxilo (CuO-COOH) tuvo potencial zeta negativo. potencial. Todas las Ag NP analizadas tenían un fuerte potencial zeta negativo que oscilaba entre -56,6 mV en el caso de nanopartículas de plata recubiertas (cAg) y -27,7 mV en el caso de nanoplata (nAg). En el medio de cultivo celular RPMI (RPMI CCM), el potencial zeta de las NP fue negativo para todas las NP, desde −8,9 mV (CuO–NH2) hasta −10,8 mV (CuO), muy probablemente debido a la adsorción de las proteínas séricas. (la llamada “corona de proteínas”, un camuflaje dinámico resultante de la adherencia de proteínas en la superficie de las NP) como lo sugirieron previamente Ivask et al.24. Por lo tanto, asumimos que la adsorción de proteínas enmascaró al menos parcialmente el efecto de las cargas de NP en todos los experimentos posteriores. La disolución entre Ag NP fue mayor en el caso de Ag2O y menor en el caso de nAg.

El efecto sinérgico se caracterizó por primera vez utilizando el medio de prueba de cultivo celular RPMI porque contiene suero sanguíneo con factores de crecimiento, lo que lo hace similar al trasudado que aparece durante la infección del tejido. En la Fig. 1 se muestra un ejemplo del efecto antibacteriano sinérgico de las NP. Para demostrar el efecto sinérgico, utilizamos una concentración bactericida mínima (MBC, la concentración más baja probada que no produjo crecimiento bacteriano visible en un medio de crecimiento agarizado) como sustituto. Si bien se requirieron 40 mg/l de NP de Ag o 400 mg/l de NP de CuO para inactivar irreversiblemente E. coli, solo se necesitaron 5 mg/l de NP de Ag + 25 mg/l de NP de CuO cuando se usaron en combinación (Fig. 1).

La sinergia antibacteriana entre CuSO4 y cAg. La suspensión de Escherichia coli K-12 se incubó con diferentes concentraciones de Ag NP, CuSO4 o sus combinaciones en medio de cultivo celular RPMI durante 24 h. Después de la incubación, se pipetearon 3 µl de la mezcla de bacterias y NP en caldo agarizado y se determinó la concentración bactericida mínima (MBC, la concentración más baja probada que no produjo crecimiento bacteriano visible después de 24 h de incubación a 37 °C en la oscuridad). En los ejes se muestran las concentraciones de cAg y CuSO4. La concentración bactericida mínima de CuSO4 y cAg fue de 400 mg/L y 40 mg/L respectivamente.

Para cuantificar y comparar el efecto sinérgico entre diferentes NP y entre varias cepas bacterianas, introdujimos el término "coeficiente de sinergia antibacteriana", K (AbS), que muestra la eficiencia antibacteriana de las combinaciones de NP (mezcla) en comparación con la suma de los valores de MBC. de NP individuales y se calcula de la siguiente manera (Ec. 1):

La ecuación (1) muestra el cálculo del coeficiente de sinergia antibacteriana (K (AbS) a partir de concentraciones bactericidas mínimas (MBC).

Vaidya et al.16 informaron anteriormente sobre un cálculo de sinergia similar para mezclas de metales. K(AbS) > 1 marca sinergia, K(AbS) = 1 marca efecto aditivo o K(AbS) < 1 marca antagonismo.

La Figura 1 demuestra que el MBC de la mezcla de NP de cAg y CuO es varias veces menor que el MBC de los componentes por separado. Según la fórmula de \({\text{K}}\left( {{\text{AbS}}} \right) = 1/\left( {\frac{{50\;{\text{mg}}/ {\text{L}}}}{{400\;{\text{mg}}/{\text{L}}}} + \frac{{2.5\;{\text{mg}}/{\text {L}}}}{{40\;{\text{mg}}/{\text{L}}}}} \right)\) = 1/(1/8 + 1/16) = 5,33. Así, en este ejemplo, el efecto antibacteriano de la mezcla fue 5,33 veces mayor que la suma de los efectos antibacterianos de los componentes por separado.

Los cálculos para la mezcla de 25 mg/L de CuSO4 + 5 mg/L de cAg dan como resultado el mismo K(AbS). Sin embargo, el K(AbS) es menor en otras variaciones de las relaciones CuSO4/cAg (por ejemplo, 200 mg/L de CuSO4 + 1,5 mg/L de mezcla de cAg). La diferencia entre K(AbS) dependiendo de la relación Cu/Ag se muestra en la figura complementaria 1. El K(AbS) más alto se observó principalmente utilizando la relación de 1:1 a 12,5:1 Cu/Ag.

Los valores de MBC de diferentes componentes de Cu solos y en la mezcla con cAg en diferentes bacterias se muestran en la Tabla complementaria 1. El MBC para diferentes bacterias fue similar, excluyendo a P. aeruginosa, que era resistente a los compuestos de Cu, a pesar de que cAg MBC para P. aeruginosa era similar al de otras bacterias.

El K (AbS) calculado para diferentes bacterias se muestra en la Fig. 2. Se encontró el efecto sinérgico antibacteriano evidente entre la mayoría de los compuestos de Cu y las NP de Ag (Fig. 2, Tabla complementaria 1).

Coeficiente de sinergia antibacteriana entre cAg y componentes de cobre en diferentes bacterias en el medio de cultivo celular RPMI. Se muestran los valores medios con desviación estándar. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001. cAg, nanopartículas de plata recubiertas; CuO Óxido de cobre; CuO–NH2, óxido de cobre recubierto de grupos amino; CuO–COOH, Óxido de cobre recubierto con grupos carboxi; CuSO4, Sulfato de cobre.

Entre las NP de CuO, el K(AbS) más alto con cAg se observó con CuO no funcionalizado y especialmente con CuO-NH2, ambos con carga positiva. El K (AbS) más bajo se observó con CuO – COOH cargado negativamente, siendo en su mayoría inferior a 2. Esto sugiere que la carga prístina de las NP de CuO (reflejada en el potencial zeta en el agua MQ) afectó la sinergia antibacteriana. Curiosamente, la carga de NP fue uniforme en el medio de cultivo celular debido a la corona de proteínas (Tabla 1). Esto sugiere que algunas superficies prístinas de las NP permanecieron disponibles incluso después de la formación de la corona de proteínas en el medio de cultivo celular.

El K(AbS) más alto se observó para E. faecalis y E. coli (tanto K-12 como ESBL). Es interesante observar que E. coli ESBL es más resistente a los antibióticos en comparación con E. coli K12 y también fue más resistente a cAg en este estudio. Sin embargo, los valores de K(AbS) fueron similares en el caso de estas bacterias. Para E. faecalis, se observó un alto K(AbS) en todas las combinaciones, lo que puede ser el resultado de una tasa más rápida de destrucción del ADN por los componentes de Cu en comparación con las enterobacterias (como E. coli)25.

P. aeruginosa tuvo el K(AbS) más bajo de todas las bacterias analizadas. La razón de esto podría ser el poderoso sistema antieflujo de drogas y la disminución de la permeabilidad de la membrana externa26.

Realizamos estudios adicionales con varios Ag NP y AgNO3 para determinar cuál de ellos tendría una sinergia antibacteriana más fuerte con los componentes de Cu.

La Tabla complementaria 2 muestra los hallazgos de MBC en E. coli K-12 con varios componentes de Ag y Cu en la mezcla y solos. Los K(AbS) calculados se muestran en la Fig. 3.

Coeficiente de sinergia antibacteriana (K(AbS)) entre diferentes componentes de Ag y Cu en medios de cultivo celular RPMI con cepa Escherichia coli K-12. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001, ##P < 0,01 antagonismo. Nota: K(AbS) se ha calculado como K(AbS) medio de diferentes experimentos, no a partir del MBC medio de los componentes en la mezcla o solos. Se muestran los valores medios con desviación estándar. cAg, nanopartículas de plata recubiertas; nAg, nanoplata; Ag2O, Óxido de plata; AgNO3, nitrato de plata; CuO, óxido de cobre; CuO–NH2, óxido de cobre recubierto de grupos amino; CuO–COOH, Óxido de cobre recubierto con grupos carboxi; CuSO4, Sulfato de cobre.

Cuando se mezclaron con componentes de Cu, la mayoría de las NP de Ag mostraron un alto contenido de K (AbS). Por el contrario, AgNO3 no demostró una fuerte sinergia antibacteriana con los componentes de Cu (Fig. 3, Tabla complementaria 2). Los niveles más altos de K(AbS) se observaron para tres mezclas: cAg con CuSO4 y nAg con CuSO4/CuO–NH2. El hecho de que CuSO4 y CuO-NH2 estuvieran bien disueltos (Tabla 1) y, por lo tanto, fueran una fuente de iones Cu, sugiere que los iones Cu son necesarios para la sinergia. El resultado atípico de K(AbS) se produjo en la mezcla de Ag2O y CuSO4 (sin sinergia). A diferencia de cAg y nAg, las NP de Ag2O estaban más oxidadas (disueltas). Estos datos indican firmemente que se requieren iones de Cu y NP de Ag no oxidados para lograr un fuerte efecto sinérgico antibacteriano.

A continuación, estudiamos si el medio de cultivo tenía efecto sobre la sinergia antibacteriana. MBC de cAg, CuSO4 y sus mezclas en diferentes medios se muestra en la Tabla complementaria 3, y K (AbS) en la Fig. 4. En medio de crecimiento bacteriano con alto contenido de proteínas y nutrientes, K (AbS) fue mayor. El K (AbS) más alto se produjo en el medio LB y el más bajo en MQ (Fig. 4). Es importante destacar que el crecimiento de bacterias también fue más rápido en LB (Figura complementaria 2). Esto sugiere que la sinergia es más prominente para las células en la fase activa y en división. Lo más probable es que, en condiciones de crecimiento bacteriano activo, las NP y los iones metálicos liberados de las NP tengan mejor acceso al espacio intracelular para destruir el ADN27 y dañar las proteínas. Curiosamente, los antibióticos tradicionales también inactivan las bacterias con menos eficacia en la fase de no crecimiento, especialmente S. aureus28.

Coeficiente de sinergia antibacteriana en diferentes medios. Coeficiente de sinergia antibacteriana en la mezcla de nanopartículas de plata recubiertas y sulfato de cobre en diferentes medios de crecimiento contra la cepa Escherichia coli K-12. Se muestran los valores medios con desviaciones estándar. Agua MQ MilliQ, RPMI.

Se realizaron varias pruebas adicionales para comprender los mecanismos de sinergia antibacteriana entre Cu y Ag. Se planteó la hipótesis de que la sinergia antibacteriana es función de los diferentes modos de acción del Cu y Ag. La interacción de los antibióticos betalactámicos, que dañan la membrana celular de las bacterias, y los aminoglucósidos, que inhiben la síntesis de proteínas en las bacterias, es un ejemplo bien conocido de la sinergia clásica de los antibióticos. La sinergia entre los aminoglucósidos y los β-lactámicos se ha atribuido al daño de la membrana mediado por los β-lactámicos que conduce a una mayor absorción de aminoglucósidos29.

Una hipótesis fue que uno de los componentes (NP de Cu o Ag) daña en mayor medida la membrana, permitiendo que otro componente penetre más fácilmente en la célula y dañe las estructuras internas. En este experimento se utilizó polimixina B, que altera las membranas bacterianas externas de las células gramnegativas30, como control positivo. Para verificar la hipótesis, se midió la permeabilidad de la membrana externa de dos bacterias Gram negativas, E. coli K-12 y Pseudomonas aeruginosa PAO1. Los resultados mostraron que AgNO3 y cAg dañaron la membrana externa de ambas bacterias (Figs. 5a, b). cAg requirió más tiempo para dañar la membrana en comparación con AgNO3, y la membrana de P. aeruginosa requirió más tiempo para dañarse en comparación con E. coli. Las NP de CuO y CuSO4 no causaron daños notables a la membrana, especialmente en P. aeruginosa. Estos datos sugieren que una de las formas de inactivar las células en el caso de los compuestos de Ag es destruyendo las membranas externas de las bacterias, mientras que los compuestos de Cu actúan sobre otras estructuras celulares (incluso altas concentraciones de Cu que conducen a la muerte celular en 24 h no lo hacen). no conduce a una rápida destrucción de la membrana externa). La destrucción de la membrana por Ag podría ayudar a que Cu alcance estas estructuras celulares internas en el caso de una mezcla de Ag y Cu. Basándonos en estos datos, decidimos probar esta hipótesis mezclando compuestos de Cu y Ag. También se realizó una prueba con una mezcla de compuestos de Cu y cAg. La acción dañina de cAg sobre la membrana no se vio afectada por la adición de CuSO4 o Cu-NH2 (Fig. 5c, d). También se realizaron pruebas con la adición de CuO–COOH o CuO a cAg y no se detectó (no se muestra) el efecto destructivo adicional sobre la membrana, así como con la adición de CuSO4 o Cu–NH2. Además, la adición de componentes de Cu a la polimixina B, que daña rápidamente la membrana externa, no mejoró el efecto de la polimixina B en la membrana (datos no mostrados). Además, no se ha detectado el efecto sinérgico antibacteriano entre CuSO4 y polimixina B en E. coli K-12 en la prueba MBC (K(AbS) = 1,054 ± 0,243, datos no mostrados). Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que Ag y Cu actúan de manera diferente sobre la membrana externa bacteriana, pero su acción sobre la membrana externa no es la causa principal de la sinergia antibacteriana.

Daño de la membrana bacteriana externa por compuestos de Ag y Cu o su combinación. El aumento de la fluorescencia indica daño en la membrana externa de Escherichia coli (a, c) y Pseudomonas aeruginosa (b, d) después de 30 minutos de incubación con los componentes solos (a, b) y en mezclas con cAg (c, d). . Se muestran los valores medios con desviación estándar. cAg, nanopartículas de plata recubiertas; AgNO3, nitrato de plata; CuO, óxido de cobre; CuO–NH2, óxido de cobre recubierto de grupos amino; CuO–COOH, Óxido de cobre recubierto con grupos carboxi; CuSO4, sulfato de cobre; PB, polimixina B.

La posibilidad de que los iones Cu realicen un ciclo redox entre Cu+/Cu++ se conoce como reacción similar a Fenton y puede generar especies reactivas de oxígeno (ROS) que conducen a la peroxidación de lípidos, la oxidación de proteínas y el daño del ADN31. A continuación, planteamos la hipótesis de que una mayor producción de ROS podría ser la razón de la sinergia entre los componentes de Cu y Ag. De hecho, se demostró previamente que CuO NPs13 y Ag NPs32 inducen ROS. También demostramos previamente que CuO –NH2 induce más ROS en comparación con CuO y CuO –COOH13 no funcionalizados.

La generación de ROS en este estudio se determinó tanto en condiciones bióticas (en presencia de bacterias) como abióticas (sin bacterias) (Fig. 6). Los niveles más altos de ROS se detectaron en suspensiones individuales de cAg y CuO-NH2 (Fig. 6a, b). cAg indujo los niveles más altos de ROS en condiciones abióticas (Fig. 6a), mientras que CuO –NH2 en condiciones bióticas (Fig. 6b). No se detectaron ROS en el caso de CuSO4 y AgNO3.

Producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) en suspensiones. Medición de la inducción de ROS en condiciones abióticas (a, c) y bióticas (b, d). La medición de la inducción de ROS se realizó después de la incubación con los componentes solos (a, b) o en la mezcla de componentes cAg y Cu en una proporción de 1:4 (c, d). cAg, nanopartículas de plata recubiertas; AgNO3, nitrato de plata; CuO, óxido de cobre; CuO–NH2, óxido de cobre recubierto de grupos amino; CuSO4, sulfato de cobre; RFU, unidades de fluorescencia relativas.

Se probaron ROS en la mezcla de componentes cAg y Cu (en una proporción de 1:4) para controlar la hipótesis de que el cAg producirá más ROS después de la adición de CuSO4 o CuO-NH2. Los resultados mostraron que la adición de CuO –NH2 o CuSO4 a cAg no mejoró la producción de ROS tanto en condiciones bióticas como abióticas (Fig. 6c, d). Además, se ha detectado antagonismo (p. ej., menor ROS en la mezcla de componentes de cAg + Cu en comparación con cAg solo), lo que indica que ROS no fue la causa de la sinergia antibacteriana.

Dado que la toxicidad de las NP de base metálica es causada principalmente por sus iones 10,33, decidimos medir los iones de Cu y Ag intracelulares. Para ello, utilizamos el biosensor bioluminiscente E. coli MC1061 pSLcueR/PDNPcopAlux, que produce luciferasa en respuesta al Cu y Ag34 intracelular. En esta bacteria, los iones intracelulares de Ag y Cu inducen la luminiscencia de las bacterias de forma dosis-dependiente.

Dado que las bacterias biosensoras no son selectivas y detectan tanto iones Ag como Cu, no fue posible determinar Ag y Cu intracelulares individualmente. Por tanto, utilizamos los valores relativos y el coeficiente de sinergia inductiva K(InS). K(InS) se calculó de la misma manera que el coeficiente de sinergia antibacteriana. K (InS) es el recíproco de la suma de las relaciones de las concentraciones máximas de bioluminiscencia (LC) de los componentes en la mezcla con respecto a las concentraciones máximas de LC solas (Ec. 2).

La ecuación (2) muestra el cálculo del coeficiente de sinergia inductiva (K (InS)) a partir de las concentraciones máximas (conc) de bioluminiscencia (LC).

Al principio, se midió la bioluminiscencia de bacterias con componentes individuales de Ag y Cu (Fig. 7a). Luego, mezclamos componentes de Cu con cAg y encontramos un cambio significativo en el pico de LC hacia la izquierda (Fig. 7b), pero ningún cambio al mezclar con AgNO3 (Fig. 7c). Las concentraciones máximas de LC de los componentes por separado y en la mezcla se muestran en la Tabla complementaria 4.

Luminiscencia de bacterias biosensoras como reacción a componentes. Luminiscencia (LC) de Escherichia coli MC1061 pSLcueR/PDNPcopAlux como reacción a 4 h de incubación con componentes solos (a). El desplazamiento significativo del pico de LC hacia la izquierda en la mezcla de componentes de cobre con cAg en comparación con cAg solo (b). No hay desplazamiento del pico LC en la mezcla de componentes de cobre con AgNO3 en comparación con AgNO3 solo (c). Las figuras representativas provienen de 3 experimentos independientes. cAg, nanopartículas de plata recubiertas; AgNO3, nitrato de plata; CuO, óxido de cobre; CuO–NH2, óxido de cobre recubierto de grupos amino; CuO–COOH, Óxido de cobre recubierto con grupos carboxi; CuSO4, Sulfato de cobre.

La alta inducción de bioluminiscencia en respuesta a la concentración intracelular de iones Cu y Ag se observó en las mezclas de componentes Cu con cAg (Fig. 7b). Se requirieron concentraciones más bajas de componentes cAg y Cu en las mezclas para la inducción de la respuesta. En combinación de componentes de Cu con cAg, todas las mezclas analizadas mostraron un alto K(InS), pero no en las mezclas de componentes de Cu y AgNO3 (Fig. 8). El hecho de que K (InS) fuera notablemente superior a 1 en el caso de las mezclas de componentes de cAg y Cu reveló que las bacterias biosensoras detectaron concentraciones intracelulares más altas de iones metálicos en la mezcla de componentes de cAg y Cu en comparación con la suma de los componentes por separado. Esto no se atribuyó al daño de la membrana causado por cAg y al mejor acceso de Cu a los componentes internos de las células (Fig. 5c, d). Se puede suponer que la concentración intracelular de Ag, cuando se combina con CuSO4, fue mayor debido a una mejor disolución de cAg en presencia de Cu2+. Además, la disolución de AgNO3 es muy alta y los iones Cu no pueden mejorarla, por lo que no observamos el efecto sinérgico entre los componentes de Cu y AgNO3.

Coeficiente de sinergia inductiva en una mezcla de componentes de Cu y Ag. La inducción de bioluminiscencia en bacterias fue mayor en respuesta a la mezcla de componentes de cAg y Cu en comparación con los componentes solos. Esta reacción mejorada no se ha detectado en la mezcla de NP de AgNO3 y CuO. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001, ##Antagonismo P < 0,01. cAg, nanopartículas de plata recubiertas; AgNO3, nitrato de plata; CuO, óxido de cobre; CuO–NH2, óxido de cobre recubierto de grupos amino; CuO–COOH, Óxido de cobre recubierto con grupos carboxi; CuSO4, Sulfato de cobre.

A continuación, investigamos la disolución de Ag NP en agua y RPMI CCM en dos condiciones diferentes: con y sin la adición de CuSO4. Encontramos una diferencia significativa entre la disolución de Ag NP con y sin adición de CuSO4 (Fig. 9). En agua MQ, la diferencia en la disolución de nAg y Ag2O fue más de 4 veces y 2 veces respectivamente después de la adición de CuSO4. Mientras que en RPMI CCM la diferencia en la disolución de nAg fue más de 16 veces después de la adición de CuSO4 (Fig. 9). Suponemos que en la mezcla de nAg y CuSO4 en el agua existe el efecto de mejorar la disolución de Ag NP mediante la siguiente ecuación. 3:

Disolución de nanopartículas de plata. Porcentaje de disolución de los componentes de plata (100 mg/L) en agua y en RPMI CCM con y sin adición de CuSO4 (400 mg/L) después de 24 h de incubación en agitador a 37 °C. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001. cAg, nanopartículas de plata recubiertas; nAg, nanoplata; Ag2O, Óxido de plata; AgNO3, nitrato de plata; CuSO4, sulfato de cobre; RPMI CCM, medios de cultivo celular del Roswell Park Memorial Institute.

La ecuación (3) muestra la reacción redox entre los componentes de cobre y plata.

En RPMI, lo más probable es que la reacción esté influenciada por compuestos orgánicos. Por ejemplo, la disolución de AgNO3 en RPMI CCM que contiene suero podría ser del 100%, pero la mayoría de los iones Ag+ libres forman complejos con proteínas séricas35. Debido a que los iones Cu impiden que los iones Ag se unan a las proteínas séricas, hubo una diferencia significativa en la concentración de iones Ag libres en una solución de AgNO3 en RPMI CCM con y sin CuSO4. Ambos efectos están presentes en una suspensión de nAg y CuSO4 en RPMI CCM, lo que da como resultado un aumento de 16 veces en la cantidad de iones de Ag libres en una muestra que contiene CuSO4 en comparación con una muestra sin CuSO4 (Fig. 9). Además, como se describió anteriormente, el Ag2O ya oxidado no tuvo sinergia antibacteriana en RPMI CCM con CuSO4 y no observamos una mejor disolución de Ag2O en este solvente después de la adición de CuSO4 (Fig. 9).

Como se mencionó en la sección anterior (Ec. 3), Cu+ se produce en la mezcla de Ag NP e iones Cu2+. Para probar la presencia de Cu+ en la mezcla, se realizó una reacción química cualitativa como se describe en la sección Métodos. En una mezcla de componentes, la reacción cualitativa demostró la presencia de Cu+, pero no en suspensión de nAg, soluciones de AgNO3 o CuSO4 por separado. Esta investigación demostró que el equilibrio se estableció como se esperaba. Además, se ha demostrado previamente que el Cu+ tiene un mayor efecto antibacteriano en comparación con el Cu2+36,37, debido a la capacidad del Cu+ para generar radicales OH en presencia de superóxido en una reacción análoga a la reacción tipo Fenton38. Por lo tanto, la formación de iones Cu+ adicionales en la solución puede estar entre los principales factores que afectan la sinergia antibacteriana del sistema Ag NP/Cu2+.

Comúnmente, la sinergia ocurre cuando los componentes tienen diferentes mecanismos de acción. Aunque la sinergia antibacteriana entre los componentes de Ag y Cu (principalmente metales y no NP) se ha descrito anteriormente, los mecanismos de sinergia no se han estudiado. Publicaciones anteriores sugirieron algunos mecanismos de sinergia antibacteriana, mientras que los autores plantearon principalmente la hipótesis de que Ag se dirige a la membrana plasmática bacteriana, mientras que Cu desnaturaliza los ácidos nucleicos y otras biomoléculas internas y estructuras celulares15,16,19,22. Por el contrario, en nuestro estudio, no observamos una sinergia notable entre los componentes de Cu y AgNO3 (Fig. 2) o Polimixina B, los cuales causaron un daño notable a la membrana (Fig. 5).

Además, se ha propuesto que los iones Cu liberados de las aleaciones de CuO inactivan las bacterias al aumentar la producción de ROS, lo que causa daño al ADN y peroxidación lipídica16,19,22. Además, las NP de Ag ancladas en CuO y Cu (OH) 2 produjeron ROS en mayores cantidades en comparación con CuO39, pero en este caso, la producción de ROS podría mejorarse debido al Cu (OH) 2. Sin embargo, no observamos una producción significativa de ROS en solución de CuSO4 en condiciones bióticas o abióticas, mientras que la producción de ROS por cAg fue notablemente mayor. Por el contrario, la adición de CuSO4 redujo la cantidad de producción de ROS en suspensión de cAg en condiciones bióticas y abióticas (Fig. 6).

Jang y otros. (2020) mostraron que la liberación de iones Ag+ de las NP fue significativamente mayor en la solución con mayor concentración de iones Cu2+23. Además, la mayor liberación de Ag+ se relacionó con la mayor temperatura y el mayor tiempo de incubación de las NP21. Este mecanismo de sinergia está en línea con los resultados de nuestro estudio.

Nuestra investigación ha demostrado que una combinación de NP de Ag no oxidadas e iones de Cu es esencial para el efecto antibacteriano sinérgico. La sinergia antibacteriana entre las NP de Ag y los componentes de Cu, según nuestro estudio, tiene al menos tres razones. Primero, los iones Cu facilitan la oxidación de Ag0 no oxidado (Ec. 3) en una reacción redox y, como resultado, una mejor disolución de Ag+ de Ag NP en solventes en presencia de Cu2+ (Fig. 9). De hecho, el Ag0 no oxidado en las NP es necesario para que la reacción redox con Cu2+ produzca Ag+ y Cu+. Una mejor disolución de las NP de Ag conduce a una mayor concentración de Ag+ en el disolvente e intracelularmente en las bacterias (Fig. 7), lo que provoca un efecto antibacteriano más fuerte. La segunda razón es la producción de iones Cu+ en la misma reacción redox (Ec. 3). Los iones Cu+ son más antibacterianos en comparación con el Cu2+38. La tercera razón es que los iones de Ag libres se unen a las proteínas en el medio de cultivo de manera menos efectiva en presencia de Cu2+, lo que resulta en una mayor concentración de Ag+ libre en la solución (Fig. 9). Por lo tanto, la liberación de iones Cu2+ de las NP de CuO es necesaria para la acción sinérgica. Todos los procesos descritos pueden ocurrir tanto a nivel extracelular como intracelular, siendo este último más perjudicial para la homeostasis celular. Además, otros factores, como el potencial zeta y la funcionalización de la superficie de NP, podrían tener algunos efectos menores sobre la sinergia antibacteriana, pero para demostrarlo se requieren más estudios.

Ag y Cu se han utilizado por separado como agentes antibacterianos desde la antigüedad. Nuestro estudio demostró que el efecto antibacteriano de la mezcla de NP que contiene componentes de Ag y Cu era hasta seis veces mayor que la suma de los efectos antibacterianos de los componentes individuales. Los mecanismos de la sinergia son: mejor disolución de Ag en presencia de iones Cu debido a la oxidación en la reacción redox, producción de más iones Cu+ antibacterianos durante la misma reacción redox y unión menos favorable de iones Ag a proteínas del medio en presencia de iones Cu. La sinergia antibacteriana entre Ag y Cu podría ser una solución ideal para algunos problemas médicos donde se necesita la eliminación de infecciones y donde el efecto antibacteriano de Ag o Cu por sí solos no es suficiente. Por ejemplo, los resultados del estudio se pueden utilizar para desarrollar nanotecnología combinatoria que se utilizará en apósitos antibacterianos para tratar heridas infectadas. Dado que el tratamiento de algunas infecciones bacterianas de heridas es un problema sin resolver, el tratamiento combinado de heridas basado en NP de Cu y Ag podría reducir las complicaciones de la infección de heridas (como gangrenas y amputaciones relacionadas con infecciones) y aumentar los años de vida ajustados por calidad (AVAC) de los pacientes. pacientes.

Todos los productos químicos eran al menos de grado analítico. La polimixina B y el NaCl se adquirieron en Sigma-Aldrich Co. (EE.UU.); AgNO3 de JT Baker (EE.UU.), CuSO4 de Alfa Aesar Gmbh & Co. (Alemania); diacetato de 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína de Life Technologies (EE.UU.); solución salina tamponada con fosfato de Biognost (Croacia); triptona, extracto de levadura y agar de LabM (Reino Unido); RPMI 1640 con glutamina y piruvato de sodio de Corning (EE.UU.); Suero Fetal Bovino de Gibco (EE.UU.).

Se obtuvieron tres tipos de NP de CuO funcionalizadas y no funcionalizadas de PlasmaChem GmbH (Alemania). PlasmaChem sintetizó CuO NP mediante descomposición de Cu2CO3(OH)2, seguida de la introducción de los grupos superficiales mediante tratamiento con ácido mercaptopropiónico. Las NP de Ag recubiertas (cAg) se obtuvieron de Laboratorios Argenol SL (España), las NP de Ag no recubiertas (nAg) de Sigma-Aldrich (EE. UU.). Nosotros sintetizamos las NP de Ag2O (Ag2O) como se describe a continuación.

Las NP comerciales se proporcionaron como polvos secos y las suspensiones se prepararon recién preparadas cada vez antes de las pruebas en concentraciones de 2000 mg de compuesto/l en agua Milli-Q® (MQ) libre de endotoxinas. Diez mililitros de suspensiones de CuO NP se agitaron y se sonicaron utilizando sonicación con sonda (Branson 450 Sonifier, EE. UU.) durante 5 minutos con una potencia acústica de 13 W correspondiente a la energía específica de 3,9·105 kJ/m340.

La morfología y el tamaño primario de todas las NP excepto Ag2O se caracterizaron en nuestros estudios previos8,13,41.

La caracterización de las NP de Ag2O mediante cristalografía de rayos X y microscopía electrónica de transmisión se realizó en la Universidad de Tartu. Las mediciones de microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM) se realizaron con el instrumento FEI Titan Themis 200 corregido con Cs. Las muestras se prepararon en alcohol isopropílico, se sonicaron y se depositaron en rejillas TEM cubiertas con una película de carbono. Después de la evaporación del disolvente, las muestras se midieron simultáneamente con detectores de campo brillante (BF) y de campo oscuro anular de alto ángulo (HAADF).

El tamaño hidrodinámico (Dh), el índice de polidispersidad (PDI) y el potencial zeta (potencial Zeta) de las NP se midieron en suspensiones de 100 mg/l en agua MQ o en medio de cultivo celular del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) con 10% de FBS y 1 % de piruvato de sodio (RPMI CCM) utilizando Malvern Zetasizer (Zetasizer Nano-ZS, Malvern Instruments, Reino Unido).

El contenido de metales de los compuestos ensayados se determinó mediante espectroscopía de absorción atómica (AAS) (contrAA 800, Analytik Jena Ag). Los materiales y las nanopartículas se incubaron en 1 ml de HNO3 concentrado (ácido nítrico trazametal grado 67–69 %, Seastar Chemicals) durante 24 h a 65 ֯ C. Después de la incubación, la suspensión se agitó y se diluyó 1:1000 en HNO3 al 1 %. El tejido y el suero sanguíneo se incubaron en H2O2 (Perdrogen 30%, Sigma-Aldrich) y se concentraron HNO3 en la siguiente proporción 1:1:8 (tejido: H2O2: HNO3) y se incubaron durante 24 h a 65 ֯ C. Después de la incubación, el La suspensión se diluyó 10 veces en HNO3 al 1% y se analizó por AAS. Las mediciones se realizaron por triplicado en al menos dos experimentos independientes.

Se disolvió nitrato de plata de grado reactivo analítico (anhidro, con una pureza superior al 99,9%) (5 mmol, 0,85 g) en 50 ml de agua desionizada y se sometió a ultrasonidos durante 1 min para lograr una solución homogénea a temperatura ambiente.

Después de que el nitrato de plata se disolviera por completo, se añadió rápidamente hidróxido de sodio (10 mmol, 0,39 g) a la mezcla de reacción en condiciones ambientales y se sometió a ultrasonidos durante 2 h.

La solución final se enfrió. Luego, el precipitado negruzco obtenido se filtró sobre papel de filtro Whatman (Grado 5) y se inactivó dos veces con 50 ml de agua MQ. Luego se secó el residuo negro a 70°C durante 12 h proporcionando rendimientos superiores al 60%.

Escherichia coli MG1655 K-12 (E.coli K-12) (obtenida del centro de stock genético de E. coli, Universidad de Yale), Escherichia coli ESBL (aislada de la orina de un paciente varón de 72 años con prostatitis crónica en West-Tallinn Central Hospital), Pseudomonas aeruginosa PAO1 (obtenido del Prof. Patrick Plesiat, Besanc, Francia), Streptococcus disgalactiae DSM 23,147 (obtenido de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares del Instituto Leibniz, Braunschweig, Alemania), E. coli bioluminiscente recombinante MC1061 (pSLcueR /pDNPcopAlux, construido en nuestro laboratorio previamente por Ivask et al.34), Enterococcus faecalis ATCC 29,212 (obtenido del Hospital Central de West-Tallinn) y Staphylococcus aureus ATCC 25,923 (obtenido del Hospital Central de West-Tallinn) se almacenaron en Luria agarizada. –Medio Bertani (LB, 1% triptona, 0,5% extracto de levadura, 0,5% NaCl, 1,5% agar) y antes de las pruebas se cultivó en 3 mL de RPMI a 37 °C con agitación a 200 rpm durante la noche. Después del cultivo durante la noche, se mezclaron 400 µl de inóculo con 20 ml de RPMI CCM, se incubaron durante 4 h y se cultivaron hasta la fase exponencial. Después de la incubación, se midió la densidad óptica de la suspensión bacteriana a 620 nm (DO620) y se preparó la suspensión a la DO620 deseada. En el caso de bacterias recombinantes, RPMI CCM se complementó con 100 µg/l de ampicilina y 10 µg/l de tetraciclina para retener el plásmido que codifica la bioluminiscencia.

El MBC se determinó mediante la concentración más baja que mata el 99,9% de la población bacteriana inicial mediante la prueba puntual descrita por Suppi et al.42. Después de cultivo durante la noche y 4 h de incubación hasta la fase exponencial, como se describió anteriormente, se obtuvo la suspensión bacteriana con OD620 0,07 (corresponde a 2 x 108 células/mL43) en MQ, RPMI CCM o LB. Se agregaron 100 µL de suspensión bacteriana a 100 µL de componentes solos o su mezcla en el medio. Las bacterias se expusieron en RPMI CCM, LB o MQ en microplacas de 96 pocillos (BD Falcon) a 30 °C durante 24 h sin agitar en la oscuridad. Se pipetearon 3 µl de la suspensión incubada sobre medio LB agarizado y se evaluó visualmente la viabilidad de las células bacterianas (formación de colonias) después de 24 h de incubación. Cada experimento fue repetido al menos tres veces.

Las bacterias fueron preparadas para la prueba como se describe en el párrafo “Evaluación de la concentración mínima bactericida (CBM)”. Se incubó una suspensión bacteriana con una DO620 de 0,03 en MQ, RPMI CCM o LB durante 3 h a 37 °C en un agitador y se midió la densidad bacteriana a una DO620.

La permeabilización de la pared celular de E. coli y P. aeruginosa por AgNO3, cAg, CuO, CuO–COOH, CuO–NH2, CuSO4 y Polimixina B (PB, control positivo) se analizó mediante la absorción celular de N-fenilnaftalen-1- amina (1-NPN) esencialmente como lo describen Helander y Mattila-Sandholm44. A diferencia de un ambiente hidrofílico, la fluorescencia de 1-NPN aumenta significativamente en un ambiente hidrofóbico (p. ej., bicapa lipídica de membrana), lo que lo convierte en un tinte apropiado para sondear la integridad de la membrana externa (OM) de las bacterias gramnegativas. Brevemente, 50 µL de 1-NPN 40 µM y 50 µL del compuesto probado en ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS) 50 mM se ajustaron con base de tris(hidroximetil)aminometano (TRIS) a pH 7,2 (MOPS-TRIS tampón) se pipetearon en los pocillos de microplacas negras. Se dispensaron 100 µl de suspensión bacteriana en tampón MOPS-TRIS 50 mM con OD = 0,5 en cada pocillo y se midió la fluorescencia después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente (luminómetro de placa Fluoroskan Ascent FL; filtros de excitación/emisión 350/460 nm). El factor de absorción celular de 1-NPN se calculó y se presentó como una relación entre la intensidad de los valores de fluorescencia de la suspensión bacteriana incubada con y sin compuestos de prueba. Se realizaron al menos tres experimentos independientes en duplicados técnicos.

La inducción de luminiscencia en bacterias mediante iones intracelulares de Ag y Cu se realizó utilizando la bacteria biosensora recombinante Escherichia coli MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux). La respuesta de E. coli recombinante a los iones intracelulares de Ag y Cu está mediada por la proteína activadora CueR y su promotor copA regulado que está fusionado a los genes que codifican la bioluminiscencia34. Por tanto, en la región subtóxica, la presencia de iones intracelulares de Ag y Cu conduce al aumento de la bioluminiscencia de estas bacterias recombinantes de forma dosis dependiente.

La preparación de las bacterias de prueba y el procedimiento del ensayo del biosensor fueron análogos al ensayo de inhibición del crecimiento bacteriano con una excepción: el medio de crecimiento del biosensor Ag bioluminiscente E. coli MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux) se complementó con 100 µg/l de ampicilina y 10 µg/l de tetraciclina durante el cultivo nocturno para mantener los plásmidos recombinantes. Se utilizó el luminómetro de placa Orion II (Berthold Detector Systems) para la medición de la bioluminiscencia (BL). Se expusieron 100 µl de suspensión bacteriana con OD620 0,1 a los componentes o su mezcla en RPMI CCM (muestra) o RPMI CCM (fondo) a 30 °C durante 4 h. Las curvas de dosis-respuesta del biosensor de Ag y Cu se obtuvieron trazando las concentraciones aplicadas de Cu y Ag frente a la bioluminiscencia del biosensor de Ag/Cu (como inducción de veces) en las muestras respectivas. La concentración con el valor de bioluminiscencia más alto de cada componente se ha marcado como el pico de LC. La inducción de veces se calculó de la siguiente manera:

donde BLmuestra es la bioluminiscencia del biosensor Ag/Cu en la muestra y BLfondo es la bioluminiscencia de fondo considerando el oscurecimiento de la luminiscencia debido a las NP.

Dado que la presencia de células puede influir en la generación y neutralización de ROS, las ROS se cuantificaron tanto en condiciones bióticas (en presencia de células) como abióticas (sin células).

Para estudiar la producción de ROS celular (biótica), se disolvió una reserva fresca de diacetato de 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína (H2DCFDA) en etanol hasta una concentración de 0,6 mg/ml y posteriormente se diluyó en tampón de fosfato de sodio 0,1 M. Se pipetearon 100 µl de componente en agua MQ en los pocillos. Luego, se agregaron 100 µL de cultivo bacteriano (E. coli K-12 a OD620 = 0,1) en agua MQ. Las placas de prueba se incubaron a 30 °C durante 4 h. Después de la incubación, se dividieron alícuotas de 100 µl de la mezcla en placas de 96 pocillos negras no transparentes y se añadió H2DCFDA a las células a una concentración final de 1,5 µg/ml. Después de 30 minutos de incubación, se midió la fluorescencia utilizando un lector de microplacas (excitación/emisión a 485/527 nm). En el ensayo, el H2DCFDA se difunde a través de la membrana celular y las esterasas intracelulares lo procesan hasta obtener una diclorofluorescina (DCFH) no fluorescente. Luego, el DCFH se convierte en 2′,7′-diclorofluoresceína (DCF) altamente fluorescente debido a la presencia de ROS intracelulares.

Para estudiar ROS en condiciones abióticas, el grupo acetato de H2DCFDA se escindió con NaOH 0,01 M a temperatura ambiente durante 30 minutos. El tinte se diluyó con tampón fosfato de Na 0,1 M hasta una concentración de 24 µg/ml y luego se añadió a cada pocillo en las placas negras no transparentes de 96 pocillos, para producir una concentración final de tinte de 12 µg/ml. Los resultados se dividieron por el blanco y se presentaron como unidades relativas de luz (RFU).

Para el análisis de disolución, se incubaron 100 mg/l de cAg, Ag2O, nAg, AgNO3, CuSO4 (un control de recuperación) en agua MQ o en RPMI CCM a 37 °C durante 24 h y luego se centrifugaron a 320.000 × g durante 30 min ( Ultracentrífuga Beckman Coulter). Después de la centrifugación, se recogieron los sobrenadantes y se analizó la concentración de plata mediante AAS (contrAA 800, Analytik Jena Ag). El porcentaje de disolución de NP se calculó según la concentración de plata en el sobrenadante después de la centrifugación, se tomó 100 mg/l como 100%. Las mediciones se realizaron por triplicado en al menos dos experimentos independientes.

La detección de Cu+ se realizó mediante el método yodométrico45. El Cu2+ quedó enmascarado por una formación de complejo con oxalato de potasio; luego, el Cu+ se oxidó a Cu2+ mediante yodato de potasio en presencia de ácido clorhídrico 2 M utilizando la solución de almidón al 1% como indicador de la presencia de yodo, que aparece cuando se completa la reacción.

Los valores de p mediante la prueba t de Student, las desviaciones estándar y los valores medios se calcularon en Microsoft Excel.

Los datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Agradecemos al Dr. Villem Aruoja (Instituto Nacional de Física Química y Biofísica, Estonia) por las correcciones en inglés del manuscrito.

EIC Accelerator Grant No. 190199469 (NANOWOUND) de la Comisión Europea (Grigory Vasiliev, Anna-Liisa Kubo, Olesja Bondarenko). Beca GOVSG16 del Consejo de Investigación de Estonia (Grigory Vasiliev, Anna-Liisa Kubo, Olesja Bondarenko). Arengufond_OB Beca del Fondo de Desarrollo del Instituto Nacional de Física Química y Biofísica (Grigory Vasiliev, Anna-Liisa Kubo, Olesja Bondarenko). Beca PRG749 del Consejo de Investigación de Estonia (Anne Kahru). Beca COVSG5 de la Agencia de Investigación de Estonia (Denys Bondar, Yevgen Karpichev). El estudio fue financiado parcialmente por el proyecto del Fondo Europeo de Desarrollo Regional “Órdenes emergentes en cuántica y nanomateriales” (TK134).

Laboratorio de Toxicología Ambiental, Instituto Nacional de Física Química y Biofísica, Akadeemia tee 23, 12618, Tallin, Estonia

Grigory Vasiliev, Anna-Liisa Kubo, Heiki Vija, Anne Kahru y Olesja Bondarenko

Nanordica Medical OÜ, Vana-Lõuna tn 39a-7, 10134, Tallin, Harjumaa, Estonia

Grigory Vasiliev, Anna-Liisa Kubo y Olesya Bondarenko

Departamento de Química y Biotecnología, Universidad Tecnológica de Tallin, Akadeemia tee 15, 12618, Tallin, Estonia

Grigory Vasiliev, Denys Bondar y Yevgen Karpichev

Academia de Ciencias de Estonia, Kohtu 6, 10130, Tallin, Estonia

Madre Kahru

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Conceptualización, GV, OB; Curación de datos, GV y A.-LK; Análisis formal, GV; Investigación, GV, A.-LK y OB; Metodología, GV, A.-LK, OB, HV y DB; Administración de proyectos, OB, AK, YK; Recursos, AK, YK y OB; Validación, OB; Visualización, GV; Redacción de borradores, GV y OB; Revisión del manuscrito, GV, A.-LK, OB, HV, DB, YK, AK Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Correspondencia a Olesja Bondarenko.

A.-LK, GV, OB son cofundadores de Nanordica Medical que desarrolla productos antibacterianos basados ​​en nanopartículas. AK, DB, HV e YK no declaran tener intereses en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Vasiliev, G., Kubo, AL., Vija, H. et al. Efecto antibacteriano sinérgico de las nanopartículas de cobre y plata y su mecanismo de acción. Representante científico 13, 9202 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36460-2

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Recibido: 27 de enero de 2023

Aceptado: 04 de junio de 2023

Publicado: 06 de junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36460-2

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