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Jun 10, 2023

El estrés mixto por metales pesados ​​induce una respuesta global a la falta de hierro

The ISME Journal volumen 17, páginas 382–392 (2023)Cite este artículo 3078 Accesos 2 Citas 54 Detalles de Altmetric Metrics La contaminación múltiple por metales pesados ​​es un problema global cada vez más común.

The ISME Journal volumen 17, páginas 382–392 (2023)Cite este artículo

3078 Accesos

2 citas

54 altmétrico

Detalles de métricas

La contaminación múltiple por metales pesados ​​es un problema global cada vez más común. Los metales pesados ​​tienen el potencial de alterar el ciclo biogeoquímico mediado por microbios. Sin embargo, faltan estudios a nivel de sistemas sobre los efectos de las combinaciones de metales pesados ​​en las bacterias. Para este estudio, nos centramos en el subsuelo de la Reserva Oak Ridge (ORR; Oak Ridge, TN, EE. UU.), que está contaminado con varios metales pesados ​​y altas concentraciones de nitrato. Utilizando un aislado nativo de Bacillus cereus que representa una especie dominante en este sitio, evaluamos el impacto combinado de ocho contaminantes metálicos, todos en concentraciones relevantes para el sitio, en los procesos celulares a través de un enfoque multiómico integrado que incluyó proteómica de descubrimiento, metabolómica dirigida, y perfiles de expresión genética específicos. La combinación de ocho metales afectó la fisiología celular de una manera que no podría haberse predicho sumando las respuestas fenotípicas a los metales individuales. La exposición a la mezcla de metales provocó una respuesta global de falta de hierro que no se observó durante las exposiciones individuales a metales. Esta alteración de la homeostasis del hierro resultó en una disminución de la actividad de las nitrato y nitrito reductasas que contienen cofactor de hierro, las cuales son importantes en la eliminación biológica de nitratos en el sitio. Proponemos que los efectos combinatorios de la exposición simultánea a múltiples metales pesados ​​son una forma subestimada pero significativa de estrés celular en el medio ambiente con el potencial de alterar los ciclos globales de nutrientes e impedir los esfuerzos de biorremediación en sitios de desechos mixtos. Nuestro trabajo subraya la necesidad de pasar de estudios de un solo metal a estudios de múltiples metales para evaluar y predecir los impactos de contaminantes complejos en los sistemas microbianos.

A partir del siglo XX, se produjeron niveles crecientes de contaminación por metales pesados ​​en ambientes acuáticos [1, 2] y terrestres [3, 4] debido a mayores aportes antropogénicos provenientes de la urbanización, los procesos industriales y las actividades agrícolas. Independientemente de la fuente de entrada específica, un tema común que surge en los sitios contaminados es la presencia simultánea de múltiples metales pesados ​​en concentraciones elevadas [2, 5,6,7,8]. Un metaanálisis reciente realizado por Zhou et al. [2] recopiló concentraciones de metales pesados ​​para cuerpos de agua superficiales globales y comparó estos valores con los límites establecidos por la OMS y la EPA de EE. UU. De 1972 a 2017, la contaminación por metales pesados ​​en las aguas superficiales pasó de metales únicos a metales múltiples.

La contaminación por metales pesados ​​no sólo es perjudicial para la salud humana [9], animal [10, 11] y vegetal [12], sino que también altera el ciclo natural de los elementos a través del impacto en la actividad microbiana. Aponte et al. [13] encontraron que los contaminantes individuales de metales pesados ​​disminuían linealmente las actividades de enzimas microbianas clave del suelo, particularmente aquellas involucradas en el ciclo del carbono y el azufre. En los sistemas del suelo, los contaminantes individuales de metales pesados ​​inhiben múltiples pasos de las vías de desnitrificación, lo que resulta en la acumulación de intermediarios tóxicos, incluidos el nitrito y el óxido nitroso, un gas de efecto invernadero [14,15,16]. Sin embargo, los estudios que investigan los impactos de combinaciones ambientalmente relevantes de metales pesados ​​en los microorganismos ambientales son escasos. Un único informe de Dey et al. [17] exploraron la respuesta proteómica del microorganismo eucariota Aspergillus fumigatus al estrés multimetálico y sugirieron un papel para las vías de recambio de proteínas y las proteínas antioxidantes en esta respuesta. Sin embargo, este estudio no examinó si esta respuesta se debió a efectos interactivos sinérgicos o aditivos de los metales en la mezcla. En sistemas procarióticos, los estudios limitados sobre esta forma de estrés se han centrado exclusivamente en determinaciones de valores de IC50 para combinaciones binarias de metales [18,19,20,21,22,23,24]. Por ejemplo, Fulladosa et al. [18] exploraron la toxicidad sinérgica/antagonista de pares binarios de metales en Vibrio fisheri determinando valores de CI50 para metales individuales y combinaciones binarias de metales. Descubrieron que los pares Co-Cu y Zn-Pb y los pares Co-Cd, Cd-Zn, Cd-Pb y Cu-Pb eran sinérgicos y antagónicos en sus impactos sobre el crecimiento de V. fisheri, respectivamente. [18]. Sin embargo, el mecanismo de estos efectos interactivos sigue siendo desconocido y el impacto de la exposición múltiple a metales en la regulación de los genes bacterianos y el metabolismo aún está inexplorado.

El subsuelo de la Reserva Oak Ridge (ORR) del Departamento de Energía de EE. UU. (DOE) en Oak Ridge, Tennessee, está contaminado con ácido nítrico y múltiples metales pesados, lo que lo hace ideal para investigar los impactos de la contaminación multimetálica en las comunidades microbianas nativas [25 ]. La contaminación en este sitio es el resultado de la descarga de desechos líquidos de las operaciones de procesamiento de uranio en el Complejo de Seguridad Nacional Y-12 en estanques de desechos sin revestimiento (conocidos como estanques S-3) desde 1951 hasta 1983 [26]. El subsuelo de la región inmediatamente adyacente a los antiguos estanques S-3 (Fig. 1a) está contaminado con altos niveles de uranio (U) y nitrato (Fig. 1b,c), así como con concentraciones elevadas de otros metales, como níquel (Ni), cadmio (Cd), cobre (Cu), aluminio (Al), manganeso (Mn) y hierro (Fe) (Fig. S1) [26, 27]. Como el nitrato es un co-contaminante importante, el impacto de estos contaminantes metálicos en el ciclo del nitrógeno por parte de los microorganismos en el sitio es un importante punto de preocupación [28, 29]. Anteriormente, aislamos la cepa CPT56D-587-MTF de Bacillus cereus (denominada cepa CPTF) de los sedimentos del subsuelo del área inmediatamente adyacente a los antiguos estanques S-3, denominada Área 3 (Fig. 1a). La cepa CPTF lleva a cabo una reducción disimilatoria de nitrato a amonio (DNRA) a través de NarGHI y NasDE [30] y es un aislado representativo de una variante de secuencia de amplicón (ASV) muy abundante que se encuentra en los sedimentos subterráneos del Área 3. En un estudio reciente, esta CPTF -ASV coincidente tuvo la abundancia relativa más alta en todas las muestras del Área 3, hasta un 10-40% del total de lecturas en varias muestras, lo que sugiere que la cepa CPTF representa una especie dominante en esta región [30]. Por lo tanto, este aislado es ideal para estudios detallados de respuestas fisiológicas a factores estresantes relevantes del sitio.

a Mapa que muestra la ubicación de la ORR en Estados Unidos (EE.UU.). El mapa de EE. UU. se generó utilizando la función get_stamenmap en el paquete ggmap R implementado en RStudio [88]. El inserto del mapa muestra el sitio de estudio: las regiones del subsuelo inmediatamente adyacentes a los antiguos estanques S-3 (indicados por un cuadro discontinuo amarillo). El área 3 está marcada con un cuadro rojo discontinuo. El sitio de aislamiento de CPTF descrito en Goff et al. (2022) también está marcado. Distribución de (b) nitrato (mM) y (c) uranio (μM) en el agua subterránea del Área 3 y en muestras de agua subterránea tomadas de dos sitios cercanos al Área 3 y los antiguos estanques S-3. Todos los mapas satelitales se generaron en Google My Maps. Imágenes: ©2022 Maxar Technologies. Datos del mapa: ©2022 Servicio Geológico de EE. UU.

Evaluamos el impacto de una mezcla de ocho contaminantes metálicos principales del subsuelo ORR (Al, U, Mn, Fe, Cd, Cu, Co y Ni) en la cepa CPTF de B. cereus. Comparamos el crecimiento de la cepa CPTF en presencia de metales individuales con el de cuando se agregan metales en combinación. Utilizando un enfoque proteómico basado en espectrometría de masas (MS) de alto rendimiento, comparamos las respuestas a nivel de sistema de las células expuestas a la mezcla de metales con las expuestas a metales individuales. Validamos y ampliamos aún más estos resultados con una combinación de metabolómica específica basada en EM y perfiles de expresión genética específicos. Finalmente, para explorar el impacto potencial en el ciclo del nitrógeno en ORR, examinamos los efectos de la mezcla de metales en la reducción de nitratos y nitritos mediante la cepa CPTF.

Bacillus cereus str. CPT56D-587-MTF (denominada cepa CPTF) [30, 31] se sembró rutinariamente en placas LB y se cultivó durante la noche a 30 °C. Se inoculó una única colonia aislada en caldo LB y se cultivó durante la noche agitando a 200 rpm a 30 °C. El cultivo nocturno se diluyó 100 veces en un medio definido anóxico suplementado con nitrato (denominado medio experimental B. cereus o medio BCE) para experimentación adicional (Información de respaldo). Para la exposición a metales, se utilizó una mezcla de metales ambientales (COMM) ORR contaminada [32] que contiene: 500 µM AlK(SO4)2·12H2O, 50 µM UO2(CH3COO)2, 50 µM MnCl2·4H2O, 50 µM NiSO4·6H2O , CoCl2·6 H2O 15 µM, (NH4)2Fe(SO4)2·6H2O 5 µM, CuCl2·2H2O 5 µM y Cd(CH3COO)2·2H2O 2,5 µM. Se usaron las mismas sales metálicas y concentraciones para los tratamientos de metales individuales.

La cepa CPTF se cultivó en 10 ml de medio BCE modificado con COMM o las concentraciones de metales individuales descritas anteriormente. El crecimiento se determinó tomando medidas de densidad óptica a 600 nm (OD600) en un espectrofotómetro.

La cepa CPTF se cultivó en cultivos de 50 ml por triplicado en medio BCE anóxico modificado con COMM o las concentraciones de metales individuales descritas anteriormente. Los cultivos de control no tuvieron modificaciones. Después de 10 h de crecimiento a 30 °C, se recogieron muestras para análisis proteómico. Se extrajo la proteína y se prepararon péptidos trípticos siguiendo procedimientos de preparación de muestras proteómicas establecidos. Los péptidos se analizaron utilizando un sistema UHPLC Agilent 1290 (Santa Clara, CA) acoplado a un espectrómetro de masas Thermo Scientific Obitrap Exploris 480 (Waltham, MA) [33]. Se utilizó el paquete de software DIA-NN (adquisición independiente de datos con redes neuronales) para la identificación y cuantificación de péptidos (Información de respaldo) [34]. Brevemente, se inyectaron 20 µg de péptidos digeridos con tripsina en una columna Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 (2,1 mm de diámetro interior, 100 mm de longitud, 1,9 µm de tamaño de partícula, 120 Å de tamaño de poro) que funcionaba a 60 °C. Los péptidos se eluyeron de la columna usando un gradiente de 10 minutos desde 98% de tampón A (99,9% H2O, 0,1% de ácido fórmico) y 2% de tampón B (99,9% de acetonitrilo, 0,1% de ácido fórmico) hasta 65% de tampón A y 35 % de tampón B. El espectrómetro de masas funciona en modo independiente de los datos con un ciclo de trabajo de 3 escaneos de estudio MS1 y 45 escaneos MS2. Para el análisis de los datos, los datos sin procesar se analizaron mediante la búsqueda en una base de datos de secuencias FASTA (modo sin biblioteca) que contiene las proteínas del genoma de interés [31, 35] y contaminantes proteómicos comunes. DIA-NN genera automáticamente un conjunto de precursores de señuelo a partir de la base de datos de secuencias para controles negativos y posteriormente utiliza redes neuronales profundas para obtener valores q para distinguir entre precursores de objetivo y señuelo [34]. Informa el área del pico de cromatografía iónica integrada de los precursores identificados como valores cuantitativos de abundancia de péptidos. Recientemente, DIA-NN se comparó con otros cinco flujos de trabajo de DIA (Spectronaut, Skyline, DIA-Umpire, ScaffoldDIA) en muestras complejas [36]. Las matrices cuantitativas sobre el nivel de proteína se extrajeron de los principales informes de DIA-NN y se procesaron mediante un script de Python automatizado descrito en un protocolo establecido [37]. Para el análisis cuantitativo, los valores de abundancia de péptidos se sumaron a la abundancia de proteínas. A continuación, se promediaron las abundancias de proteínas de las réplicas de la muestra y se calcularon la desviación estándar y el coeficiente de variación porcentual. La imputación de los valores faltantes se logró reemplazando los valores faltantes con un valor cuantitativo de 1000, un valor ~90% del valor más bajo en el conjunto de datos (LLOD). Para el análisis comparativo, los valores de p ajustados se calcularon mediante la prueba t de Welch con ajuste de Benjamini-Hochberg y los valores de p ajustados inferiores a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Se utilizó la metabolómica cuantitativa basada en EM para validar las observaciones proteómicas de las vías metabólicas reguladas diferencialmente. La cepa CPTF se cultivó en 200 ml de medio BCE (n = 5 réplicas) modificado con COMM. Los cultivos de control no tuvieron más modificaciones en el medio. Después de 10 h de crecimiento a 30 °C, se tomaron muestras de las células para su análisis. Los metabolitos intracelulares se cuantificaron utilizando un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Agilent 6495 con una fuente de corriente en chorro, acoplado a una pila UPLC Agilent 1290 (Información de respaldo). Los estados de transición de MS para los compuestos objetivo se proporcionan en la Tabla S1. Los datos se procesaron utilizando el software cuantitativo Agilent. Los límites de cuantificación se dan en la Tabla S2.

La cepa CPTF se cultivó por triplicado en 500 ml de medio BCE. Los cultivos de control no tuvieron más modificaciones en el medio. Un segundo conjunto de cultivos de control se modificó con (NH4)2Fe(SO4)2·6H2O 5 µM, la misma cantidad de hierro (Fe) presente en el COMM. Los cultivos tratados con COMM se modificaron con metales como se describe anteriormente. Antes de la inoculación, se recogió una muestra de medio de cada botella de cultivo para determinar las concentraciones iniciales de Fe. Luego los cultivos se cultivaron durante 10 h a 30 °C y se tomaron muestras para su análisis. El análisis de espectroscopía de masas/plasma acoplado inductivamente se realizó utilizando un espectrómetro de masas cuádruple único Agilent 7900 para cuantificar el contenido total de hierro del medio de cultivo no inoculado, el medio gastado y los extractos de células completas (Información de respaldo).

Para los ensayos de actividad de nitrato y nitrito reductasa, la cepa CPTF se cultivó en 500 ml de medio BCE con o sin adición de COMM a 30 °C. Después de 10 h de crecimiento, las células se recogieron mediante centrifugación a 6600 x g a 4 ° C durante 15 min. Las células se lavaron una vez en tampón de fosfato potásico 50 mM previamente enfriado (pH 7,0). Los ensayos de nitrato y nitrito reductasa se realizaron utilizando una versión modificada del procedimiento descrito por Thorgersen y Adams [38] (Información de respaldo).

La cepa CPTF se cultivó en cultivos de 50 ml por triplicado en medio BCE. Un conjunto de cultivos se dejó sin tratar como control. Un conjunto fue tratado con el COMM descrito anteriormente. Después de 10 h de crecimiento a 30 °C, se extrajo el ARN y se preparó el ADNc (Información de respaldo). La qRT-PCR cuantitativa se realizó con Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent). Los cebadores se diseñaron para amplificar el producto de ~150 pb dentro de los genes objetivo (Tabla S3). Se utilizó el gen recA (UIJ64731.1) como gen de referencia. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante la prueba t de Student.

En el subsuelo contaminado de ORR, coexisten múltiples metales en concentraciones elevadas junto con altos niveles de nitrato [26]. Para explorar la toxicidad de estos metales, expusimos la cepa CPTF de B. cereus aislado de ORR a una mezcla de metales ambientales (COMM) de ORR contaminada que contiene ocho metales, Al3+ (500 µM), U6+ (50 µM), Mn2+ (50 µM), Fe2+. (5 µM), Cd2+ (2,5 µM), Co2+ (15 µM), Cu2+ (5 µM) y Ni2+ (50 µM), donde las concentraciones reflejan las que normalmente se encuentran en aguas subterráneas contaminadas con ORR (Fig. 1, Fig. S1, Tabla S4). Los experimentos de crecimiento se realizaron en condiciones anóxicas y de respiración de nitrato. En comparación con el control, los cultivos de cepa CPTF cultivados con COMM tuvieron una tasa de crecimiento más lenta y un menor rendimiento de crecimiento (Fig. 2a). Para determinar si los metales individuales también inhiben el crecimiento, las células se cultivaron con los componentes COMM individuales en sus concentraciones COMM. Para todos los cultivos expuestos a metales mencionados anteriormente, comparamos el crecimiento en el punto de transición entre la fase exponencial y estacionaria (10 h) (Fig. 2b). No hubo diferencias significativas (p > 0,05) entre el crecimiento del cultivo de control y el crecimiento durante Al, U, Mn, Co, Fe o Cd. Sin embargo, el crecimiento con Ni y Cu fue de 87 ± 3,9% y 92 ± 4,4% del control, respectivamente (p < 0,05). Consideramos que la toxicidad del COMM puede ser el resultado de los efectos aditivos o sinérgicos del Ni y Cu, levemente tóxicos. Sin embargo, el defecto de crecimiento de CPTF cultivado con Ni y Cu en sus concentraciones de COMM no fue tan grande como el observado en presencia de COMM (Fig. S2). Estos datos sugieren que la toxicidad combinada de los metales COMM es mayor de lo que se podría predecir a partir de la suma de las partes individuales.

a La evaluación del crecimiento se realizó en condiciones anóxicas de respiración de nitrato con glucosa (20 mM) como fuente de carbono. Las concentraciones añadidas de los metales individuales se indican en la leyenda. El COMM es una mezcla de todos los metales en las mismas concentraciones que están presentes individualmente (Tabla S4). Cada punto de tiempo representa un promedio de tres réplicas. Para mayor claridad, las barras de error no se muestran, pero se pueden ver en la Tabla S5. El cuadro discontinuo indica el momento de las 10 h en el que se recolectaron muestras para el análisis proteómico que se describe más adelante en el manuscrito. b Crecimiento en el momento de las 10 h. Las barras de error representan ±SD. Los datos son el promedio de tres réplicas.

Además, examinamos las interacciones de los metales COMM dentro del sistema celular de la cepa CPTF utilizando un enfoque basado en proteómica. Comparamos la respuesta proteómica de las células cultivadas con COMM con las células cultivadas con tratamientos metálicos individuales. Se cultivaron cultivos de CPTF por triplicado con el COMM o con metales individuales en las mismas concentraciones en las que están presentes en el COMM. Los cultivos de control no tenían metales añadidos distintos de los del medio estándar. Todos los cultivos se cultivaron en condiciones anóxicas y con respiración de nitrato. Se recolectaron muestras para análisis proteómico basado en EM a las 10 h (Fig. 2). En las diez condiciones se identificaron un total de 1303 proteínas únicas (Tabla S6). Las proteínas diferencialmente abundantes en cultivos tratados con metales se identificaron mediante comparación con cultivos de control sin exposición a metales. En resumen, se identificaron 295 proteínas diferencialmente abundantes (p <0,05) en los nueve tratamientos de metales (COMM y ocho metales individuales; Fig. 3a, Tabla S7). De estas 295 proteínas, 191 (65%, denominado Grupo 1) fueron diferencialmente abundantes sólo en los cultivos tratados con COMM. El resto (35%, Grupo 2) fue diferencialmente abundante en el COMM y uno o más tratamientos de metales individuales o solo en los tratamientos de metales individuales.

a Diagramas de red de proteínas diferencialmente abundantes a las 10 h de crecimiento en condiciones de respiración anóxica de nitrato (n = 3 réplicas). Los nodos grandes representan la condición del tratamiento del metal. Los nodos pequeños representan proteínas individuales diferencialmente abundantes (en relación con el control no tratado). Los bordes indican las condiciones bajo las cuales las proteínas son diferencialmente abundantes. Los mapas de red muestran proteínas cuya abundancia aumentó (i) o (ii) disminuyó en respuesta a los tratamientos con metales. Los colores de los nodos/bordes pequeños (la leyenda se muestra en la imagen) representan el número de grupos de tratamiento que comparten las proteínas diferencialmente abundantes. Los colores de las nubes de fondo distinguen las proteínas del Grupo 1 (verde: sólo diferencialmente abundantes en el tratamiento COMM) de las proteínas del Grupo 2 (púrpura: todas las demás proteínas). b Comparaciones funcionales de proteínas del grupo 1 y del grupo 2 utilizando categorías COG. La categoría S (función desconocida) está excluida de la visualización para mayor claridad. Todas las demás categorías no estaban representadas en los proteomas diferencialmente abundantes.

Un total de 276 de las 295 proteínas diferencialmente abundantes se asignaron a categorías de Grupos de genes ortólogos (COG) [39] (Fig. 3b). La comparación funcional de las proteínas del Grupo 1 con las del Grupo 2 reveló un enriquecimiento de ~ 2,5 veces de la Categoría E del COG (metabolismo y transporte de aminoácidos) entre las proteínas del Grupo 1. Un análisis más detallado reveló que varias de estas proteínas del Grupo 1, Categoría E, estaban involucradas en la biosíntesis del aminoácido esencial triptófano. Además, ninguna de las proteínas del Grupo 2 pertenecía a la Categoría Q (biosíntesis, transporte y catabolismo de metabolitos secundarios). Por el contrario, diez (5%) de las proteínas del Grupo 1 cayeron en la Categoría Q del COG. Estas incluyeron varias involucradas en la biosíntesis del sideróforo bacilibactina. La bacilibactina es un sideróforo tripéptido de tipo catecolato secretado por miembros del género Bacillus para la quelación del hierro férrico (Fe3+) del medio ambiente durante períodos de limitación de hierro [40]. Estas dos observaciones son interesantes ya que se predice que las vías biosintéticas de triptófano y bacilibactina de la cepa CPTF compartirán la corismita como un intermediario común [41, 42]. El corismato es el punto de ramificación en la biosíntesis de aminoácidos aromáticos y otros metabolitos aromáticos [43].

Un análisis más detallado de los patrones de abundancia de proteínas específicas reveló que las enzimas de biosíntesis de bacilibactina isocorismato sintasa (DhbC), 2,3-dihidrozibenzoato deshidrogenasa (DhbB) y (2,3-dihidrozibenzoato)adenilato sintasa (DhbE) solo se detectaron en cultivos expuestos a COMM. tratamiento pero no en control o cultivos individuales de exposición a metales (Fig. 4a). Cuando había estándares comerciales disponibles, realizamos análisis dirigidos de metabolitos intracelulares basados ​​en MS para confirmar los cambios en el flujo de la vía metabólica sugeridos por los datos proteómicos. DhbC (ON, +6,8 log2FC imputado) cataliza la conversión de corismato en isocorismato. Probablemente debido a su papel como intermediario de punto de ramificación, las concentraciones de corismato fueron bajas en todas las muestras y no se observaron diferencias en sus concentraciones entre los cultivos de control y COMM (Fig. 4b). Luego, el isocorismato se convierte en 2,3-dihidroxi-2,3-dihidroxibenzoato mediante DhbB (ON, imputado +9,6 log2FC) y luego en 2,3-dihidroxibenzoato mediante una enzima que no era diferencialmente abundante. Descubrimos que los niveles intracelulares de 2,3-dihidroxibenzoato aumentaron 8,7 veces en respuesta a la exposición a COMM (Fig. 4b), probablemente debido a un mayor flujo metabólico a través de la vía. En bacterias como Bacillus subtilis, el 2,3-dihidroxibenzoato se secreta como sideróforo además de su función como intermediario biosintético [44, 45]. La adenilación de 2,3-dihidrozibenzoato a (2,3-dihidrozibenzoato)adenilato está catalizada por DhbE (ON, imputado +6,4 log2FC). El paso final es la formación del tripéptido bacilibactina mediada por una péptido sintasa no ribosómica que no es diferencialmente abundante en nuestro conjunto de datos.

Para todos los paneles, los asteriscos indican cambios log2 imputados debido a la no detectabilidad del péptido en las condiciones comparadas. Este cambio se imputó a partir de un valor cuantitativo de 1000, un valor de aproximadamente el 90 % del valor más bajo del conjunto de datos (LLOD). a Patrones de abundancia de proteínas a través de las enzimas de la vía biosintética de bacilibactina y triptófano. Los mapas de calor muestran cambios promedio (n = 3 réplicas) de abundancia log2 de proteínas individuales en las diferentes condiciones de tratamiento en relación con el control (de izquierda a derecha: COMM, U, Al, Mn, Fe, Co, Cu, Cd, Ni). Los números entre paréntesis a la derecha de los nombres de las proteínas indican el cambio log2 veces específico de la proteína en los cultivos expuestos a COMM. La escala del mapa de calor (que se muestra con cambios de abundancia log2 veces respecto al control) se encuentra en la parte inferior de la imagen. Los cuadros azules indican una mayor abundancia de proteínas (p <0,05), los cuadros rojos indican proteínas cuya abundancia disminuyó significativamente (p <0,05) y los cuadros blancos no indican una diferencia significativa en la abundancia en relación con el control. Las proteínas de la ruta que carecían de un mapa de calor no tuvieron cambios significativos en los patrones de abundancia en ninguna de las condiciones probadas. b Gráficos de concentraciones intracelulares de metabolitos seleccionados de la vía biosintética de bacilibactina/triptófano (n = 5 réplicas). Las líneas centrales representan valores medianos. Los rangos intercuartiles y los valores máximo/mínimo están representados por rangos de cajas y rangos de bigotes, respectivamente. Los valores medios se indican con una “x”. Los puntos internos están marcados con puntos. * p < 0,01, ** p < 0,001. c Patrones diferenciales de abundancia de proteínas de supuestos transportadores de bacilibactina. Los detalles del mapa de calor son los mismos que en (a).

En contraste con la vía biosintética de la bacilibactina, la abundancia de tres enzimas en la vía biosintética del triptófano disminuyó significativamente en respuesta al tratamiento con COMM (Fig. 4a), aunque tampoco hubo cambios en su abundancia con ninguno de los tratamientos con metales individuales. Estos incluían la antranilato sintasa (TrpE, −7,3 log2FC), que cataliza la conversión de corismato en antranilato. Respaldando esta observación, las concentraciones de antranilato intracelular disminuyeron 2,0 veces en respuesta a la exposición a COMM (Fig. 4b). La antranilato fosforribosiltransferasa (TrpD), que cataliza la conversión de antranilato en N-(5-fosforribosil)-antranilato, fue detectable en todas las condiciones excepto en la exposición a COMM (OFF, −8,6 log2FC imputado). De manera similar, la subunidad beta de triptófano sintasa fue detectable en todas las condiciones excepto en la exposición COMM (TrpB, OFF, −10.0 log2FC imputado). TrpB cataliza la conversión del indol intermedio aguas abajo en triptófano. De acuerdo con los niveles reducidos de TrpB y el menor flujo metabólico a través de la vía, las concentraciones de triptófano intracelular disminuyeron 1,3 veces durante la exposición a COMM (Fig. 4).

También detectamos dos supuestos transportadores de sideróforos durante la exposición a COMM que no fueron detectables en condiciones de control. Sin embargo, observamos que estos transportadores eran parte de las proteínas del Grupo 2, ya que también se detectaron durante algunos tratamientos de metales individuales (Fig. 4c). La subunidad de unión al sustrato (FeuA, ON, imputada +8,8 log2FC) del transportador tipo ATP FeuABC bacilibactina-Fe3+ [46] aumentó significativamente durante la exposición a COMM. Además, si bien no existe un homólogo de un exportador de bacilibactina caracterizado [47] en el genoma de la cepa CPTF, detectamos (ON, imputado +10,5 log2FC) un miembro de un transportador catiónico di/tripéptido de tipo superfamilia facilitadora principal (MFS) durante el crecimiento. con COMM que no era detectable bajo condiciones de control. Este transportador también se detectó durante la exposición a Cu y Ni (Fig. 4c). El transportador de bacilibactina de B. subtilis (YmfE) previamente caracterizado también es del tipo MFS [47]. Para respaldar aún más esta función propuesta, el gen que codifica este transportador (LW858_01095) se encuentra inmediatamente adyacente a un segundo sistema de transporte sideróforo-Fe3+ de tipo ABC (Fig. S3) y está aguas abajo de un regulador transcripcional de tipo ArsR sensible a metales [48]. .

Nuestros datos proteómicos y metabolómicos sugieren que se produce un aumento de la producción, exportación y reimportación de bacilibactina y/o 2,3-dihidrozibenzoato durante la exposición a COMM de B. cereus str. CPTF. Sin embargo, la biosíntesis y el transporte de membrana de sideróforos son procesos energéticamente costosos [49, 50]. Además, la absorción de hierro suele estar estrechamente regulada por las células bacterianas para evitar la mala metalización de metaloproteínas que no contienen hierro [51] y el daño oxidativo desencadenado por un exceso de hierro intracelular [52]. En B. subtilis str. CU1065 y B. cereus str. 569, los genes que codifican las enzimas biosintéticas y los transportadores de sideróforos están regulados por un regulador canónico de la absorción férrica (FUR) que reprime su regulón en condiciones de abundancia de hierro [53, 54]. Durante los períodos de falta de hierro, el régimen FUR se desreprime. Nuestra hipótesis es que la exposición a COMM induce una respuesta global de falta de hierro que implica una mayor biosíntesis de sideróforos y una mayor abundancia de transportadores de sideróforos. Además, sugerimos que el corismato se desvíe de la biosíntesis de triptófano a bacilibactina para priorizar la adquisición de hierro mediada por sideróforos. Sin embargo, observamos que tal respuesta de adquisición/inanición de hierro es desconcertante en este sistema, ya que la fuente preferida de hierro para los microorganismos, el hierro ferroso (Fe2+), es un componente del COMM.

Examinamos los datos proteómicos y realizamos análisis de expresión genética específicos para determinar si las alteraciones observadas en las vías de bacilibactina y triptófano eran indicativas de una respuesta más global de falta de hierro a la exposición a COMM, lo que sugiere una necesidad fisiológica de adquisición de hierro (Tabla 1). Para estos análisis, comparamos nuestros datos con estudios previos de respuestas celulares a condiciones de limitación de hierro. Confirmamos la presencia de un homólogo FUR en el genoma de la cepa CPTF con una identidad de secuencia del 83% (longitud completa) con B. subtilis FUR. En B. subtilis, así como en otros microorganismos modelo, esta respuesta regulada por FUR incluye: (1) mayor expresión de transportadores para la absorción de hierro (p. ej., transportadores sideróforos-Fe3+) y proteínas eliminadoras de hierro, (2) mayor biosíntesis de sideróforos y (3) una respuesta ahorradora de hierro que incluye una mayor expresión de flavodoxinas (Flds) [53, 55]. Hemos presentado evidencia anterior de un mayor transporte de hierro en la cepa CPTF. En relación con la eliminación de hierro, observamos la mayor abundancia de dos hemo monooxigenasas (HmoA y HmoB) exclusivamente durante la exposición a COMM (Tabla 1). HmoA y B catalizan la apertura del anillo de porfirina hemo para liberar Fe2+ libre [56]. Las hemo monooxigenasas son producidas por especies de Bacillus y Staphylococcus durante períodos de limitación de hierro [57,58,59].

En respuesta a la exposición a COMM, detectamos una mayor abundancia de enzimas involucradas en la biosíntesis de bacilibactina, consistente con lo que se ha observado con otras especies de Bacillus durante períodos de falta de hierro [53, 54]. Sugerimos además que las disminuciones paralelas en la abundancia de las enzimas en la ruta biosintética del triptófano son para conservar el corismato intermedio para la biosíntesis de sideróforos. En apoyo de este modelo, observamos una disminución de la abundancia de la prefenato deshidrogenasa (TyrA) exclusivamente durante la exposición a COMM (Tabla 1). TyrA cataliza la descarboxilación oxidativa del prefenato a 4-hidroxifenilpiruvato en la vía biosintética de tirosina que también utiliza corismato como intermediario [60]. No pudimos encontrar ningún caso informado de represión de la biosíntesis de triptófano o tirosina en la respuesta global a la falta de hierro de otras especies bacterianas. Este novedoso hallazgo destaca la fuerza del descubrimiento de la proteómica junto con un análisis detallado de vías para descubrir respuestas celulares no obvias al estrés ambiental. Estudios futuros deberían determinar cómo se regula esta respuesta y si ocurre en otros sistemas bacterianos.

Para adaptarse a condiciones de limitación de hierro, las bacterias suelen tener una respuesta ahorradora de hierro para minimizar la síntesis de enzimas abundantes, no esenciales, que contienen hierro y enzimas involucradas en la biosíntesis del cofactor de hierro [61]. La respuesta ahorradora de hierro de B. subtilis está bajo el control regulatorio postranscripcional del sRNA FsrA (análogo a RhyB en bacterias gramnegativas) y tres proteínas básicas pequeñas (FbpA, FbpB y FbpC) [62]. Esta respuesta incluye una disminución de la expresión de enzimas que contienen hierro del ciclo del TCA, enzimas de biogénesis de citocromo y porfirina, enzimas de biosíntesis de cisteína, enzimas que contienen hierro de las vías biosintéticas de isoleucina y glutamato sintasa que contiene hierro [62, 63]. Durante la exposición a COMM, observamos de manera similar una disminución en la abundancia de CPTF sulfato adenililtransferasa (CysN) y adenilil-sulfato quinasa (CysC), así como de sulfito reductasa dependiente de ferredoxina (Sir / CysI) (Tabla 1). Especulamos que la disminución de la abundancia de enzimas que no contienen hierro de la vía biosintética de la cisteína se debe al papel de la cisteína como donante de azufre en la biosíntesis de grupos de hierro-azufre [64]. También observamos niveles reducidos de glutamato sintasa (GltB) durante la exposición a COMM (Tabla 1). Finalmente, observamos una disminución en la abundancia de la subunidad NarH de la nitrato reductasa respiratoria que contiene grupos de hierro y azufre. Estudios previos con B. subtilis durante la limitación de hierro se realizaron en condiciones óxicas cuando no se produce nitrato reductasa respiratoria. Sin embargo, se han demostrado niveles reducidos de esta enzima en Escherichia coli durante la limitación de hierro en condiciones anóxicas [65].

En relación con la respuesta ahorradora de hierro, la proteína Fld está regulada positivamente en los tres dominios de la vida durante los períodos de limitación de hierro [66,67,68]. La flavodoxina es una pequeña proteína de transferencia de electrones que contiene un cofactor mononucleótido de flavina. Durante condiciones bajas en hierro, los organismos aumentarán la producción de Fld, que puede reemplazar la ferredoxina que contiene hierro y azufre como donante fisiológico de electrones para diversas reacciones de oxidorreductasa [66, 68]. En consecuencia, observamos una mayor producción de Fld en el proteoma expuesto a COMM de la cepa CPTF en relación con el control (Tabla 1). Los niveles de Fld no fueron alterados por ninguno de los tratamientos de metales individuales.

Utilizamos qRT-PCR para validar los cambios representativos de la abundancia de proteínas observados durante la exposición a COMM. Seleccionamos 11 transcripciones para representar las diversas partes de la respuesta global propuesta a la falta de hierro de la cepa CPTF. De estas 11 transcripciones, siete (dhbB, dhbC, dhbE, mfs, sir, fld y hmoA) fueron consistentes con los patrones de abundancia de sus respectivos productos proteicos durante la exposición a COMM (Fig. S4). Sin embargo, cuatro transcripciones (feuA, trpB, trpD y trpE) no se expresaron diferencialmente a pesar de los grandes cambios en la abundancia de sus productos proteicos observados en las mismas condiciones. La discrepancia entre los niveles de expresión de la transcripción de feuA (ns) y los niveles de proteína FeuA (+8,8-log2FC) es probablemente el resultado de cambios temporales en la expresión génica durante la transición a la fase estacionaria que comienza en nuestro punto de tiempo de muestreo (10 h) y retraso posterior en los cambios en el nivel de proteínas [69]. Por el contrario, los niveles de proteína TrpBDE disminuyeron durante la exposición a COMM mientras que su abundancia de transcripción no cambia, lo que sugiere una regulación postranscripcional o postraduccional de este producto peptídico. Estos resultados enfatizan la utilidad de los enfoques proteómicos y transcriptómicos combinados.

Si bien se ha observado previamente una mayor abundancia de proteínas involucradas en la biosíntesis y el transporte de sideróforos durante experimentos individuales de exposición a metales [70, 71], no hay informes de una respuesta de falta de hierro en la medida observada aquí con la cepa CPTF durante la exposición a COMM. Además, estos estudios previos han utilizado altas concentraciones de metales pesados ​​que no son relevantes ni siquiera para ambientes contaminados, o la exposición a metales pesados ​​se realiza en condiciones de deficiencia de hierro [72]. Por ejemplo, en B. subtilis, la exposición al cobre (500 µM) induce la expresión de las enzimas biosintéticas de bacilibactina, así como del transportador de bacilibactina-Fe3+. Sin embargo, no se observaron cambios de expresión para las hemo monooxigenasas o Fld. Además, varias enzimas que contienen hierro en realidad se regulaban positivamente durante la exposición al cobre y no hubo evidencia de una respuesta ahorradora de hierro [73]. Por lo tanto, la exposición de la cepa CPTF a COMM parece inducir un estado fisiológico de falta de hierro más comparable al inducido por quelantes de hierro o al que se observa en las cepas mutantes Δfur [53].

Las concentraciones de hierro soluble son elevadas en el agua subterránea ORR contaminada ([Fe]AVG = 5,6 µM) en relación con el agua subterránea ORR no contaminada ([Fe]AVG = 0,35 µM) [29, 32]. En nuestros experimentos, el [Fe] soluble fue de 3,7 y 5,3 µM de Fe en los cultivos de control y modificados con COMM, respectivamente. El hierro COMM se añade en forma ferrosa (Fe2+). Debido a la insolubilidad del Fe3+ a pH neutro, esta concentración total de hierro soluble en el medio refleja [Fe2+]. Sin embargo, observamos que la exposición a COMM induce un estado fisiológico de falta de hierro que no se observa en los tratamientos con metales individuales ni en los cultivos de control. Consideramos que los componentes de COMM pueden competir con el Fe2+ por el transporte transmembrana, limitando la absorción de Fe2+. Sin embargo, en comparación con los cultivos de control, los cultivos expuestos a COMM importaron en exceso hierro con concentraciones de hierro intracelular total de 22,0 y 151,1 µM, respectivamente (Fig. S5A). Como control adicional, modificamos los cultivos de CPTF con hierro ferroso 5 µM (el mismo que el presente en el COMM) y medimos las concentraciones de hierro intracelular. Si bien estos cultivos absorben aproximadamente un 50% más de hierro que el control sin modificar (33,6 frente a 22,0 µM, respectivamente), estos valores siguen siendo menores que los medidos para los cultivos expuestos a COMM. Después de la incubación y el crecimiento celular, la [Fe]aq disminuyó pero aún> 1 µM en todas las muestras de medios gastados (Tabla S8).

Los metales individuales dentro de la COMM también pueden alterar la homeostasis del hierro intracelular al desplazar el hierro en los sitios de unión de metales de las enzimas, un proceso conocido como mala metalización, que es un mecanismo conocido de toxicidad para muchos metales pesados ​​[74]. Proponemos que los metales individuales en el COMM puedan apuntar a diferentes etapas del ensamblaje del cofactor de hierro y los procesos de inserción para diferentes enzimas. Durante la exposición individual al metal, las células parecen controlar este estrés mediante la regulación positiva de proteínas para la reparación y biosíntesis del cofactor de hierro con un defecto de crecimiento mínimo o nulo (Fig. 2). Por ejemplo, observamos una mayor abundancia de proteínas de ensamblaje y reparación de grupos de hierro-azufre (IscA y Ric), así como de proteínas de biosíntesis de hemo (HemFH), durante la exposición de la cepa CPTF a Cd y Cu (Fig. S5B). Sin embargo, en combinación, esa respuesta al estrés aparentemente se ve abrumada, tal vez porque múltiples metales se dirigen a una gama más amplia de enzimas que contienen hierro, lo que resulta en una alteración significativa de la homeostasis del hierro intracelular. Los niveles de dos proteínas de biosíntesis de hemo (HemFH) aumentan durante la exposición a COMM en relación con el control, mientras que las proteínas de reparación/ensamblaje del grupo hierro-azufre no lo hacen, lo que sugiere que se puede priorizar el hierro para la biosíntesis de hemo en estas condiciones. Las mayores tasas de síntesis del cofactor de hierro necesarias para superar el desplazamiento del hierro por otros metales podrían conducir a un cambio significativo en el equilibrio de Fe2+ intracelular, lo que llevaría a la desrepresión de FUR.

Las condiciones de respiración de nitrato utilizadas para nuestros experimentos imitan el subsuelo ORR contaminado debido a las altas concentraciones de nitrato antropogénico. Sin embargo, el ciclo del nitrógeno en el sitio puede verse influenciado por co-contaminantes de metales pesados. Se ha medido la acumulación de nitrito en las aguas intersticiales de núcleos de sedimentos ORR contaminados, lo que sugiere una inhibición de la reducción de nitrito in situ [75]. La cepa CPTF lleva a cabo DNRA a través de la nitrato reductasa respiratoria NarGHI y la nitrito reductasa NasDE [30]. Tanto NarGHI como NasDE contienen cofactores de hierro [76, 77]. Por lo tanto, buscamos determinar si la desregulación de la homeostasis del hierro en la cepa CPTF inducida por COMM afecta la actividad de estas dos enzimas. Encontramos que la actividad de la nitrito reductasa NasDE estaba casi ausente (0,25 ± 0,44 unidades·OD600-1) en cultivos de CPTF expuestos a COMM en relación con los cultivos de control (12,11 ± 7,48 unidades·OD600-1) (Fig. 5a) . Sin embargo, los niveles de ambas subunidades proteicas se mantuvieron sin cambios entre los cultivos control y expuestos a COMM (Fig. 5b), lo que sugiere que la pérdida de actividad se debe a la inhibición directa de la enzima por parte de los metales. Descartamos la inhibición directa de la holoenzima nitrito reductasa mediante inhibición alostérica o desplazamiento de centros metálicos (Tabla S9). En cambio, proponemos que los metales COMM se incorporen incorrectamente durante la biosíntesis del cofactor de hierro, lo que resulta en una mala metalización de la apoenzima nitrito reductasa que produce una nitrito reductasa inactiva.

a Actividad de las nitrato y nitrito reductasas con (barras rojas) o sin (barras grises) COMM. Una unidad de actividad representa 1 nmol de nitrato/nitrato reducido por minuto. Los experimentos se realizaron por triplicado y las barras de error representan SD. b Abundancia diferencial de NarGHI y NasDE. El mapa de calor muestra cambios promedio (n = 3 réplicas) de abundancia log2 de proteínas individuales en las diferentes condiciones de tratamiento en relación con el control (de izquierda a derecha: COMM, U, Al, Mn, Fe, Co, Cu, Cd y Ni). La escala del mapa de calor (que se muestra con cambios de abundancia log2 veces respecto al control) se encuentra en la parte inferior de la imagen. El número de átomos de Fe por proteína se determinó a partir de sus homólogos de Bacillus subtilis (UP000001570) (c) Cambios relativos en la expresión de narG, narH y narI con (barras rojas) y sin (barras grises) exposición a COMM. Los experimentos se realizaron por triplicado y las barras de error representan ± DE. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

También observamos una disminución de la actividad de la nitrato reductasa en los cultivos expuestos a COMM en relación con el control (9,38 ± 6,00 frente a 31,57 ± 6,03 unidades·OD600-1) (Fig. 5a). Como se señaló anteriormente, la exposición a COMM resultó en niveles reducidos de la subunidad NarH de la nitrato reductasa en comparación con el control (Fig. 5b), lo que sugiere que la disminución en la actividad se debe, en parte, a niveles más bajos de proteína. Sin embargo, no se observaron cambios en la abundancia de NarG y NarI (Fig. 5b). Esta diferencia en los cambios de abundancia relativa entre las tres subunidades es desconcertante ya que las tres están presentes en el mismo operón y deberían coregularse. De hecho, el análisis de la expresión génica confirmó la disminución de la expresión de narH, así como de narI y narG (Fig. 5c). Esta discrepancia entre los cambios a nivel de proteína y a nivel de transcripción probablemente se deba a diferentes controles postraduccionales en los tres productos proteicos. Es probable que la disminución de la expresión de narGHI sea parte de la respuesta ahorradora de hierro descrita anteriormente. En un momento posterior, las tres subunidades de proteínas probablemente habrían disminuido en los cultivos expuestos a COMM en relación con el control. Sin embargo, en el momento en que se realizaron todas las mediciones, es posible que los niveles de NarH ya hayan estado sujetos a una regulación postraduccional, posiblemente a través de una degradación proteolítica mejorada. La mala metalización de los centros de cofactores metálicos puede provocar un plegamiento incorrecto, dirigiendo las proteínas para su escisión mediante proteasas [78]. NarH contiene una mayor cantidad de átomos de hierro que NarG o NarI: NarH contiene 15 átomos de hierro por molécula de proteína en comparación con 4 y 2, respectivamente (Fig. 5b). Especulamos que esto puede hacer que NarH sea más vulnerable a la mala metalización y al posterior recambio por parte de las proteasas que las otras subunidades. Observamos una mayor abundancia de dos proteasas CPTF exclusivamente durante el tratamiento con COMM: Clp y Hls. De manera similar a la nitrito reductasa, excluimos la posibilidad de inhibición de la holoenzima ya sea alostéricamente o mediante el desplazamiento de los centros metálicos por los metales COMM (Tabla S9). En la Fig. 6 se presenta un modelo integrado para los impactos de COMM en el nitrato y la reducción de nitrito. Nuestros datos sugieren que la inhibición del nitrito microbiano y la reducción de nitrato observada con frecuencia en sitios contaminados con metales pesados ​​[15, 79] puede ocurrir en múltiples niveles regulatorios. .

a Cambios observados en los niveles y funciones de enzimas en células CPTF expuestas a COMM en relación con el control. b Mecanismos propuestos para los cambios descritos en (a).

Los factores estresantes ambientales seleccionan funciones de la comunidad microbiana que facilitan la resiliencia dentro de ese nicho ecológico. Existe un enriquecimiento significativo de genes implicados en la respiración de nitratos y la tolerancia a metales pesados ​​en metagenomas originados en aguas subterráneas contaminadas con ORR [80, 81]. Nuestros datos sugieren que el estrés por metales múltiples induce un estado fisiológico de falta de hierro incluso en ambientes repletos de hierro como el subsuelo ORR contaminado. La extracción de datos publicados del metagenoma ORR [80] reveló una sobreabundancia significativa del gen transportador de hierro ferroso de alta afinidad efeU en un metagenoma de agua subterránea contaminada en relación con un metagenoma de un pozo de fondo prístino. EfeU es importante para la adquisición de hierro en condiciones de agotamiento de hierro [82]. Por lo tanto, las comunidades microbianas en las regiones contaminadas de ORR pueden experimentar este estado de falta de hierro inducido, seleccionando miembros de la comunidad capaces de hacer frente a este estrés. Al igual que la ORR, los sitios impactados por actividades industriales y agrícolas frecuentemente están contaminados con nitrato y múltiples metales pesados ​​[83,84,85]. Examinar la interacción entre estos co-contaminantes es esencial para la gestión del sitio y los esfuerzos de remediación. Si bien la reducción de nitratos puede ser deseable en tales sitios, la acumulación de intermediarios como nitrito y óxido nitroso puede agravar los problemas existentes [25]. Por ejemplo, el nitrito puede inhibir los procesos de biorremediación debido a la alta toxicidad del nitrito para los microorganismos incluso en concentraciones milimolares bajas. Además, en sitios contaminados con uranio como la ORR, la acumulación de nitrito puede conducir a la removilización oxidativa de uraninita a UO22+, contrarrestando los esfuerzos de biorremediación. La inhibición de la actividad enzimática debido a la alteración de la homeostasis del hierro inducida por múltiples metales podría conducir a la acumulación de estos intermediarios indeseables.

Nuestros hallazgos ponen en duda la transferibilidad de los estudios de toxicidad de un solo metal a ambientes contaminados. En estos entornos, los metales rara vez existen como entidades singulares. Sin embargo, los estudios que intentan utilizar la experimentación de laboratorio para limitar la actividad biológica en estos ambientes generalmente manejan contaminantes metálicos coexistentes como parámetros independientes [86], con una consideración mínima a sus efectos combinatorios interdependientes. La construcción de modelos metabólicos y de regulación biológica para ambientes contaminados puede tener un poder predictivo limitado si se deriva exclusivamente de experimentos de perturbación de un solo metal. Si bien los estudios de exposición a un solo metal han sido fundamentales para desarrollar una comprensión mecanística detallada de la toxicidad de los metales pesados ​​en sistemas microbianos, proponemos que es hora de pasar a estudios de perturbación de múltiples metales para reflejar mejor los factores estresantes que enfrentan los microorganismos en ambientes alterados antropogénicamente.

Los datos proteómicos de espectrometría de masas generados se depositaron en el Consorcio ProteomeXchange a través del repositorio de socios PRIDE [87] con el identificador de conjunto de datos PXD035730. DIA-NN está disponible gratuitamente para descargar desde https://github.com/vdemichev/DiaNN.

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Agradecemos a Lauren Lui y Torben Nielsen (Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley) por su ayuda inicial con la búsqueda de los datos del metagenoma publicados anteriormente. JLG también agradece a Nathan Yee (Rutgers) por las animadas discusiones sobre el tema de la resistencia de los metales en el laboratorio versus el campo que inspiró este trabajo. Este material de ENIGMA (Ecosistemas y redes integradas con genes y conjuntos moleculares) (http://enigma.lbl.gov), un programa de área de enfoque científico del Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley, se basa en un trabajo respaldado por el Departamento de Energía de EE. UU. Oficina de Ciencias, Oficina de Investigaciones Biológicas y Ambientales, bajo contrato DE-AC02-05CH11231.

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JLG y MWWA concibieron el estudio. JLG, YC, MPT, LTH, FLP, EGS y CJP realizaron la investigación y analizaron los datos. MWWA, CJP y GS supervisaron la investigación y obtuvieron fondos. JLG escribió el artículo con aportaciones de los coautores. Todos los autores contribuyeron a la revisión y edición del artículo.

Correspondencia a Michael WW Adams.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Recibido: 05 de agosto de 2022

Revisado: 08 de diciembre de 2022

Aceptado: 13 de diciembre de 2022

Publicado: 26 de diciembre de 2022

Fecha de emisión: marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-022-01351-3

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