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Jun 17, 2023

Eficacia antiviral de las nanopartículas de óxido de cerio.

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 18746 (2022) Cita este artículo 1471 Accesos 5 Citas 8 Detalles de Altmetric Metrics Los nanomateriales son posibles candidatos para la eliminación de

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 18746 (2022) Citar este artículo

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Los nanomateriales son posibles candidatos para la eliminación de virus debido a sus mecanismos de acción multimodales. Aquí, probamos el potencial antiviral de una nanopartícula de dióxido de cerio (CeO2) en gran parte inexplorada. Se evaluó la capacidad de dos nano-CeO2 con carga superficial opuesta, (+) y (-), para disminuir las unidades formadoras de placa (UFP) de cuatro virus con envoltura y dos sin envoltura durante una exposición de 1 h. La actividad antiviral estadísticamente significativa contra el coronavirus SARS-CoV-2 y el virus de la gripe ya se registró con 20 mg Ce/l. Para otros dos virus con envoltura, el virus de la gastroenteritis transmisible y el bacteriófago φ6, la actividad antiviral se evidenció a 200 mg Ce/l. Como era de esperar, la sensibilidad de los virus sin envoltura al nano-CeO2 fue significativamente menor. El picornavirus EMCV no mostró ninguna disminución en las UFP hasta la concentración más alta probada, 2000 mg Ce/ly el bacteriófago MS2 mostró una ligera respuesta no monótona a altas concentraciones de nano-CeO2(-). Las pruebas paralelas de la actividad antiviral de los iones Ce3+ y las nanopartículas de SiO2 permiten concluir que la actividad del nano-CeO2 no se debió a la liberación de iones de Ce ni a efectos inespecíficos de las nanopartículas. Además, evidenciamos una mayor eficacia antiviral del nano-CeO2 en comparación con las nanopartículas de Ag. Este resultado, junto con la baja actividad antibacteriana y la inexistente citotoxicidad del nano-CeO2, nos permiten proponer nanopartículas de CeO2 para aplicaciones antivirales específicas.

La búsqueda de agentes antivirales (materiales que permitan inactivar virus, inhibir su capacidad de infectar sus células huésped o suprimir su capacidad de replicarse1) se ha intensificado claramente con la actual pandemia de COVID-192. Recientemente se ha reconocido el potencial de la nanotecnología en el desarrollo de terapias antivirales3,4,5,6,7. Uno de los grupos de nanomateriales antivirales potenciales son las nanopartículas de metales y óxidos metálicos8 que se ha sugerido que ejercen su actividad a través de mecanismos de acción multimodal9, incluida la unión directa a la superficie del virus, la inhibición de la unión viral a las células huésped o incluso la interacción con el genoma viral10. Un espectro tan amplio de actividades antivirales propuestas para las nanopartículas a base de metales puede dar como resultado una menor probabilidad de desarrollar resistencia antiviral, lo que puede ocurrir en el caso de los medicamentos antivirales convencionales11.

Ya se ha publicado una gran cantidad de literatura sobre nanopartículas antivirales. En enero de 2022, se recuperaron 1623 artículos de ISI Web of Science utilizando las palabras clave “antiviral” Y “nanopartícula*”. De ellos, el 17% mencionó “COVID”, mientras que el 30% mencionó “plata”, el 5% “cobre”, el 5% “zinc” y el 4% “titanio O titania”. Curiosamente, todas esas nanopartículas también se encuentran entre las nanopartículas más utilizadas en aplicaciones antibacterianas12, lo que indica que se puede esperar un mecanismo de acción relativamente general, eficaz tanto contra bacterias como contra virus. La nanoplata, que contribuye a 1/3 de los artículos sobre nanopartículas antivirales, es claramente uno de los tipos de nanopartículas antivirales más estudiados. Se ha sugerido como sus modos de acción la posible unión de partículas de nanoplata a la superficie exterior de los virus y la unión de nanopartículas al material genético viral, lo que lleva a una mayor inhibición de la replicación del virus13. Se ha demostrado la eficacia de las nanopartículas de plata para disminuir los recuentos virales infecciosos contra una variedad de virus, incluido el VIH14,15,16,17, el virus del herpes simple18, el virus de la influenza19, los norovirus20, los adenovirus, así como el SARS-CoV-221 y otros virus22,23. ,24,25. Sin embargo, vale la pena mencionar que, si bien las concentraciones antivirales de las nanopartículas de plata generalmente oscilan entre decenas y cientos de mg/l26, esas concentraciones ya pueden provocar citotoxicidad21 y ciertamente exhiben un efecto antibacteriano, que generalmente se evidencia a partir de un rango bajo de mg/l27. De hecho, la citotoxicidad inespecífica y el riesgo potencial para la salud concurrente de algunas de las nanopartículas propuestas pueden ser un problema28 y, por lo tanto, las alternativas de nanopartículas más seguras con menores riesgos potenciales para la salud son sin duda de interés.

En la búsqueda de materiales antiviralmente eficaces con baja actividad hacia las células o la microbiota humana, nos centramos en nanomateriales basados ​​en CeO2. Anteriormente, la actividad antiviral de las nanopartículas de ceria se sugirió en algunos artículos relacionados con el virus de la influenza H1N1 y el virus del herpes simple29,30, el poliovirus tipo Sabin31 y el virus de la estomatitis vesicular (VS)30. Aunque el mecanismo de actividad antiviral de las nanopartículas de CeO2 no se ha estudiado en profundidad, algunos estudios sugieren que defectos en la estructura cristalina del CeO2 pueden ser responsables de su actividad biológica30. Se ha demostrado que tales defectos conducen a una reacción redox Ce(III) ⇔ Ce(IV)of en la superficie, lo que resulta en el llenado o formación de vacantes de oxígeno32 y, en última instancia, en la liberación de especies reactivas de oxígeno (ROS) de la superficie de las nanopartículas33. Curiosamente, esta formación de ROS por CeO2 se ha correlacionado con la acidez del ambiente circundante, aumentando así la toxicidad en bacterias34 así como en células cancerosas31 a valores de pH bajos. En pruebas in vitro con células de mamíferos normales y pH menos ácido, no se ha observado citotoxicidad significativa de las nanopartículas de CeO2 sino que se ha demostrado un efecto protector, de supervivencia y promotor del crecimiento35,36. Se ha propuesto que estos efectos protectores han sido causados ​​por el atrapamiento de radicales libres por el CeO2 y, por lo tanto, por la reducción del estrés oxidativo inducido por ROS37,38. Esta combinación de actividad antiviral potencial y baja toxicidad general sugiere que los materiales de CeO2 pueden ser antivirales potentes con efectos secundarios bajos.

El objetivo de este trabajo fue revelar la actividad antiviral de nanopartículas ultrapequeñas de CeO2 frente a una selección de virus de mamíferos con y sin envoltura y bacteriófagos seleccionados. Paralelamente a las nanopartículas de CeO2, probamos la actividad antiviral de nanopartículas de plata que generalmente se considera que exhiben una actividad antiviral significativa, y de sílice (SiO2), presumiblemente biológicamente inerte39. Para revelar la causa de la actividad antiviral de las nanopartículas de CeO2, estudiamos la posible inactivación de la proteína de superficie por parte de esas nanopartículas utilizando el SARS-CoV-2 como ejemplo. Finalmente, se comparó la potencia antiviral del CeO2 y otras nanopartículas seleccionadas con su actividad bactericida frente a Escherichia coli Gram-negativa y Staphylococcus aureus Gram-positiva y sus efectos citotóxicos.

Aunque el énfasis de este trabajo estuvo en los efectos antivirales de los nanomateriales de CeO2, se agregaron nanopartículas de Ag y SiO2 a las pruebas como controles para un agente antiviral generalmente aprobado y una nanopartícula inerte (Tabla 1). Reconociendo la importancia de la superficie de las nanopartículas en sus efectos biológicos, se sintetizaron nano-CeO2 con dos estados diferentes de superficie, aquellos con una superficie casi "desnuda" que lleva una gran carga positiva (nano-CeO2(+)) y nanopartículas estabilizadas por iones cítricos y, presentando así una superficie cargada negativamente (nano-CeO2 (-)). Se sintetizaron nano-CeO2(+) a una concentración máxima de 6500 mg Ce/l (aprox. 45 mM) y nano-CeO2(-) a 8200 mg Ce/l (aprox. 60 mM). En lo sucesivo, en los experimentos descritos, la concentración en mg/l de los compuestos investigados se refiere siempre a miligramos por litro del elemento, es decir, Ce, Ag o Si.

Tal como se sintetizaron, el nano-CeO2 (+) y el nano-CeO2 (-) formaron coloides acuosos estables debido a su gran potencial ζ (+ 41 mV o - 53 mV, respectivamente) (Tabla 1). Según la microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM) (en la Fig. 1 se muestran imágenes TEM representativas de nanopartículas de CeO2), el tamaño promedio de partícula tanto de nano-CeO2(+) como de nano-CeO2(-) fue cercano a 3 nm. (Figura S1). El tamaño hidrodinámico medido por dispersión de luz dinámica del nano-CeO2 (-) determinado en la concentración antiviral más alta probada fue relativamente cercano al tamaño primario de las partículas (Tabla 1) y solo el nano-CeO2 (+) mostró cierta agregación. Curiosamente, al disminuir la concentración de nano-CeO2, se observó un aumento aparente en el tamaño de las partículas y, por lo tanto, la probabilidad de agregación se observó con una concentración de partículas decreciente tanto para el nano-CeO2(+) como para el nano-CeO2(-), mientras que este último fue más sensible. a la inestabilidad mediada por dilución (Fig. S2). Sugerimos que la desorción de iones cítricos estabilizadores de la superficie de las nanopartículas tras la dilución del coloide conduce al adelgazamiento de la doble capa eléctrica de las nanopartículas y al deterioro de la estabilidad coloidal.

Imágenes HRTEM de nanopartículas sintetizadas. (A) Nano-CeO2(+), (B) nano-CeO2(-), (C) nano-Ag, (D) nano-SiO2.

Los espectros UV-Vis de nanopartículas de CeO2 (Fig. 2A) mostraron que, en comparación con el nano-CeO2 (+), el borde de absorción fundamental del nano-CeO2 (-) tenía un desplazamiento al rojo de aproximadamente 10 nm. Además, visiblemente, el coloide de nano-CeO2(-) mostró un color amarillo más intenso en comparación con el nano-CeO2(+). Esta diferencia en el cambio del borde de absorción puede deberse a la diferente relación Ce(III)/Ce(IV) en la superficie de las nanopartículas, o puede originarse a partir de iones citrato oxidados y polimerizados en la superficie de las partículas nano-CeO2(-), como un remanente del proceso de síntesis. La aparente "caída" de la absorción del coloide nano-CeO2(-) por debajo de 300 nm es un error de compensación debido a un aumento simétrico de la absorción de la solución madre (el líquido que queda después de la centrifugación de las nanopartículas) de este coloide causado, muy probablemente , por una alta concentración de iones citrato y productos de su oxidación y/o complejación con iones cerio. El espectro infrarrojo (IR) del nano-CeO2 sintetizado (Fig. 2B) concuerda con los datos de la literatura40 y muestra picos en alrededor de 3600 a 3200 cm-1, que corresponden al estiramiento –OH del agua absorbida y los grupos OH superficiales. Los picos alrededor de 1600 cm-1 y 1400 cm-1 son vibraciones deformación H – O – H y vibraciones de estiramiento C – O de moléculas de agua superficiales e iones de carbonato, respectivamente. El pico de 700 a 500 cm-1 se debe a las vibraciones de estiramiento del Ce-O. Las diferencias entre los espectros de nano-CeO2(+) y nano-CeO2(-) son principalmente intensidades de picos alrededor de 1600 cm-1 y 1400 cm-1, que en el caso de nano-CeO2(-) corresponden también a vibraciones del grupo COO-. de iones citrato absorbidos41. También observamos un pequeño desplazamiento hacia el azul de la banda desde 1539 cm-1 nano-CeO2(+) a 1546 cm-1 para nano-CeO2(-), lo que probablemente se debe a la suma de las vibraciones deformacionales H-O-H con La banda de estiramiento del grupo COO antisimétrico con un máximo debe ser de alrededor de 1585 cm-1 según los datos de la literatura41. Junto con los datos DLS, la espectroscopía UV-Vis e IR muestra claramente que, a pesar de que el tamaño medio de las partículas, la forma y los parámetros de distribución de tamaño son muy cercanos, las partículas de nano-CeO2(+) y nano-CeO2(-) son química y electrostáticamente bastante diferentes. y, por tanto, podemos esperar de ellos diferentes efectos sobre los objetos biológicos. Las concentraciones de iones Ce3+/Ce4+ establecidas experimentalmente (mediante ICP-MS) en sobrenadantes de coloides de CeO2 de 1,4 × 10–2 M (2000 mg Ce/l) fueron bastante bajas: 8 × 10–5 M (12 mg Ce/l). l) para CeO2(+) y 1,7 × 10–4 M (24 mg Ce/l) para CeO2(-). Estos valores son aún significativamente más altos que los datos de la literatura42, que deberían estar en el rango de 10–7–10–8 M, en agua a un rango de pH neutro, y probablemente sean el resultado de una separación incompleta de las nanopartículas. Sin embargo, incluso la concentración medida debería tener un efecto mínimo sobre los virus.

Características (A) espectros UV-Vis y (B) espectros infrarrojos de nano-CeO2(+) y nano-CeO2(-). En (A) también se muestra el espectro UV-Vis de la solución madre de nano-CeO2(-).

La síntesis de nano-Ag se realizó mediante la ruta del citrato mediada por semillas y la concentración máxima alcanzada fue de 480 mg/l (corresponde a 4,4 mM). Nano-SiO2 se sintetizó utilizando la técnica de Stöber y la concentración máxima alcanzada para las nanopartículas de sílice amorfa fue de 3100 mg/l (corresponde a 110 mM). Tanto las partículas de nano-Ag como las de nano-SiO2 eran esféricas con un tamaño primario promedio de alrededor de 15 nm (Tabla 1). Según el tamaño hidrodinámico y el análisis DLS, el nano-Ag permaneció en estado no agregado, mientras que el nano-SiO2 exhibió un cierto nivel de agregación y formación de 2 a 10 agregados de nanopartículas. El potencial ζ de la superficie de las partículas de nano-Ag y nano-SiO2 fue negativo (- 52 ± 5 y - 34 ± 3 mV, respectivamente), siendo comparable al nano-CeO2 (-), permitiendo así la comparación de sus efectos biológicos. Desafortunadamente, no pudimos sintetizar nanopartículas de sílice ni de plata con un tamaño primario comparable al de las nanopartículas de CeO2 sin la adición de tensioactivos fuertes que tendrían sus propias propiedades antimicrobianas pronunciadas.

Para demostrar la potencia antiviral de nano-CeO2, nano-SiO2 y nano-Ag, analizamos la disminución de los recuentos infecciosos (expresados ​​como unidades formadoras de placa, PFU) de cuatro virus de mamíferos y dos bacteriófagos después de 1 h de contacto con nanopartículas. Se utilizaron nano-CeO2 con potenciales ζ de superficie positivos y negativos para comprender el efecto de la superficie de CeO2 en su actividad antiviral. Para descartar la posibilidad de que la actividad antiviral se deba únicamente al tamaño de partícula a escala nanométrica, se realizaron pruebas paralelas de actividad antiviral con nanopartículas de SiO2 supuestamente biológicamente inertes y de baja toxicidad. Por el contrario, las partículas de nano-Ag que se considera ampliamente que exhiben un efecto antiviral se probaron como controles positivos en pruebas antivirales (consulte la Tabla 2). A pesar de la muy baja solubilidad potencial del CeO2, también probamos el efecto antiviral del compuesto soluble Ce(III) Ce(NO3)3 como fuente de iones Ce3+. Aunque ambos iones Ce3+ y Ce4+ podrían formarse en bajas concentraciones durante la disolución de CeO2, se utilizaron iones Ce3+ debido a su mayor probabilidad de presencia42.

Nuestra selección de virus incluyó virus de mamíferos y bacterianos, tanto con envoltura como sin envoltura (Tabla 2). En general, los virus envueltos por una membrana lipídica se han considerado más sensibles a la inactivación por diversas condiciones ambientales que los virus sin envoltura que poseen sólo una cápside proteica43. Los virus patógenos pueden pertenecer a cualquiera de estos grupos, por lo que la mayoría de los estándares de pruebas antivirales prevén la inclusión de ambos tipos de virus44,45. Los virus de mamíferos con envoltura utilizados en este estudio incluyeron el virus de la influenza46, el SARS-CoV-2 y el TGEV47, y se utilizó el picornavirus EMCV como modelo de los virus de mamíferos sin envoltura48. Se utilizaron Ф649 envuelto y MS250 sin envoltorio como ejemplos respectivos de virus bacteriano (bacteriófago). Ambos fagos se han sugerido como modelos para pruebas antivirales51,52,53,54. En el caso de todos los virus, la exposición a las nanopartículas se llevó a cabo en agua esterilizada o en medio de crecimiento altamente diluido durante 1 h. El número de partículas virales infecciosas con y sin tratamientos se expresó como unidades formadoras de placas (UFP/ml).

Antes de probar la actividad antiviral, se estudió el efecto de todos los compuestos probados en las células huésped virales. La mayoría de los compuestos y concentraciones probados no fueron citotóxicos para las células huésped de los virus de los mamíferos (Fig. S3). Sólo las concentraciones más altas probadas de nano-Ag, Ce(NO3)3 o SiO2 disminuyeron la viabilidad de algunas de las líneas celulares huésped, que sin embargo no interfirieron con los ensayos antivirales, donde las concentraciones de esos compuestos no alcanzaron los niveles tóxicos. A excepción del nano-Ag, ninguno de los compuestos afectó el crecimiento de las bacterias huésped de los bacteriófagos. Como la nanoplata es bien conocida por sus efectos antibacterianos, su toxicidad bacteriana que se observó a partir de 14 μM (1,5 mg/l) no fue una sorpresa. Para poder estudiar los efectos del nano-Ag hacia los bacteriófagos, su toxicidad bacteriana se neutralizó mediante la adición de un exceso molar triple de l-cisteína a la reacción de infección inmediatamente antes del paso del ensayo de placa.

Los resultados del ensayo antiviral mostraron que, a pesar de no ser tóxico para las células y bacterias de los mamíferos, el nano-CeO2 afectó la infectividad de la mayoría de los virus y bacteriófagos de los mamíferos (Fig. 3). Se observó una disminución significativa (p ≤ 0,05) de la infectividad viral debido a la exposición al nano-CeO2(+) durante 1 h a partir de 20 mg/l en el caso de SARS-CoV-2, virus de la influenza y ф6, y a partir de 200 mg/l. l en caso de TGEV (Tabla 3). Ninguno de los virus sin envoltura mostró una disminución significativa en la infectividad para nano-CeO2(+) hasta 2000 mg/l. Nano-CeO2(-) afectó la infectividad del SARS-CoV-2 y el virus de la influenza a partir de 20 mg/l y la infectividad de TGEV y ф6 a partir de 200 mg/l (Tabla 3). Siguiendo la tendencia del nano-CeO2(+), los virus sin envoltura mostraron la sensibilidad más baja hacia el nano-CeO2(-). La infectividad del EMCV no se vio afectada por el nano-CeO2(-) hasta 2000 mg/l, y la respuesta del bacteriófago sin envoltura MS2 al nano-CeO2(-) no fue monótona, de modo que 20 y 200 mg/l del compuesto disminuyó la infectividad, pero no se observó ningún efecto a 2000 mg/l. Tal efecto no monótono sobre la actividad antiviral no podría explicarse por el aumento del nivel de agregación de CeO2 en concentraciones más altas, según la medición de tamaño hidrodinámico, ya que los nano-CeO2 no estaban agregados en concentraciones más altas y la agregación e inestabilidad de las partículas aumentaban con el nivel de dilución de las partículas (Fig. S2). También se ha demostrado una respuesta no monótona para otros tipos de nanomateriales. Por ejemplo, el TiO2 presenta una toxicidad no monótona inducida por la luz ultravioleta para los organismos de agua dulce55. En el caso de las nanopartículas de CeO2, se pueden encontrar informes anteriores sobre la toxicidad no monótona para las plantas de soja56, sin embargo, sus causas exactas aún están por aclararse.

El efecto de nano-CeO2(+) (A) y nano-CeO2(-) (B) sobre la actividad formadora de placa viral (log PFU/ml). Los virus y bacteriófagos de mamíferos envueltos se muestran con símbolos abiertos; los símbolos cerrados representan virus y bacteriófagos de mamíferos sin envoltura. Las diferencias en los títulos virales iniciales se deben a diferentes rendimientos virales en condiciones de laboratorio. *p < 0,05.

Aunque propusimos que debido a las diferencias químicas y electrostáticas entre la superficie de nano-CeO2(+) y nano-CeO2(-), esas nanopartículas pueden exhibir diferentes efectos biológicos, nuestros resultados no mostraron diferencias notables entre las propiedades antivirales de esos dos tipos. de partículas (Tabla 3).

La comparación de nuestros resultados sobre las propiedades antivirales del nano-CeO2 con informes anteriores es bastante difícil debido a la naturaleza variable de las nanopartículas, así como a los métodos utilizados para la evaluación de la actividad antiviral. Sin embargo, se pueden hacer ciertas comparaciones. Por ejemplo, en un estudio de 2010, se observó una reducción de 2 log de Enterobacter aerogenes envuelto que infectaba las UFP del bacteriófago UZ1 después de su exposición de 2 h a 50 mg/l de CeO2, mientras que 500 mg/l de CeO2 fueron suficientes para disminuir la infectividad en 4 log57. Mohamed et al.31 demostraron que nano-CeO2 de tamaño 14 nm en concentraciones inferiores a 50 mg/l eliminaban todas las partículas virales infecciosas (PFU) del poliovirus tipo Sabin tipo 1 y los autores incluso sugirieron nanopartículas de CeO2 como alternativa al tratamiento de Infección por polio. Sin embargo, también hay informes que muestran que las nanopartículas de CeO2 no tienen ningún efecto sobre los virus. Según Neal et al.58 200 mg/l de nanopartículas de CeO2 no tuvieron ningún efecto significativo sobre la infectividad del coronavirus humano OC43 o del rinovirus RV14 después de 6 h de incubación. Sin embargo, después del dopado de CeO2 con Ag, la actividad antiviral de las nanopartículas de CeO2 se logró, según los autores, debido a la presencia de una mayor proporción de iones Ce(III) en la superficie de las nanopartículas, así como a la presencia de nanopartículas de plata, su tamaño , morfología y densidad de su población en la superficie de CeO2. En general, estos pocos artículos publicados hasta ahora sobre la eficacia antiviral del CeO2 han demostrado resultados relativamente variables, que pueden atribuirse a diferencias en las propiedades fisicoquímicas de las nanopartículas, a diferentes virus utilizados o ensayos antivirales aplicados. Sin embargo, según los pocos estudios anteriores que demuestran los efectos antivirales del nano-CeO231,57 y los resultados de nuestro estudio, podemos sugerir que la nanoceria tiene un potencial significativo en los tratamientos antivirales y que este potencial debe estudiarse y desarrollarse más.

En la Fig. 4 se muestra la comparación de la eficacia antiviral del nano-CeO2 en comparación con el nano-SiO2 que se usó como control negativo y el nano-Ag usado como control positivo debido a sus probables propiedades antivirales. Los virus envueltos que no mostraron ninguna sensibilidad hacia el nano-CeO2 tampoco fueron influenciados por el nano-SiO2 o el nano-Ag (Fig. 4D, F). Se esperaba el inexistente efecto antiviral de las nanopartículas de SiO2, ya que la sílice se considera biológicamente compatible o generalmente segura59,60 y de baja toxicidad. No encontramos datos publicados que hubieran indicado una actividad antiviral de las nanopartículas de SiO2. Sin embargo, se ha demostrado que las nanopartículas de sílice impiden la respuesta antiviral a la infección por norovirus, reduciendo la viabilidad de los macrófagos61.

Actividad antiviral de todas las nanopartículas y compuestos químicos probados expresados ​​en concentraciones µM para permitir la comparación. Tenga en cuenta que la actividad antiviral se expresa como una reducción del título viral infeccioso, logPFU por ml en comparación con el control no expuesto después de 1 h. Los datos de nano-CeO2 se transfieren de la Fig. 3. (A) coronavirus SARS-CoV-2; (B) virus de la gastroenteritis transmisible TGEV; (C) virus de la gripe A/WSN/1933; (D) picornavirus EMCV; (E) bacteriófago ф6; (F) bacteriófago MS2. Los símbolos cerrados en (D,F) representan virus sin envoltura. Se muestran los resultados de tres experimentos independientes con desviación estándar. Tenga en cuenta la escala logarítmica del eje y. La línea discontinua horizontal de color rojo oscuro muestra el límite de cuantificación de la reducción de UFP.

Si bien se anticipó la baja actividad antiviral del SiO2, nuestros resultados que indicaron que no había actividad antiviral significativa de nano-Ag hasta 150 mg/l (1,4 mM), a excepción del bacteriófago ф6 (Tabla 2), fueron sorprendentes. Estudios anteriores han sugerido que la nanoplata puede afectar a los virus de diversas formas; a través de interacciones con la superficie viral y, posteriormente, interfiriendo en la unión viral a sus objetivos, inhibición de la penetración viral en las células huésped o incluso interactuando con el genoma viral26, y que las nanopartículas de plata están afectando a los virus ya a partir de decenas de mg/l. Sin embargo, curiosamente, una mirada más cercana a los resultados antivirales de las nanopartículas de Ag reveló que en la mayoría de los estudios solo se ha observado una disminución relativamente pequeña, de menos de 1 log (<90%) en la infectividad. Yadavalli et al.8 han demostrado una inhibición del 50% del VIH mediante nanopartículas de Ag entre 25 y 5000 mg/l, Rogers et al.24 han demostrado una disminución del 60-80% en la actividad de formación de placas del virus de la viruela simica en presencia de 20-2000 mg/l. l de nanopartículas de Ag. Gaikwad et al.62 han demostrado una inhibición de hasta el 90 % del virus de la parainfluenza humana en presencia de 0,1 a 9 mg/l de nanopartículas de Ag. Se observó una disminución ligeramente superior, de hasta 2 log, en el título del virus de la influenza en respuesta al tratamiento con 50–70 mg/l de nanopartículas de Ag63 y Castro-Mayorga et al.20 demostraron una disminución de 4 log en la dosis infecciosa mediana de calicivirus felino en cultivo de tejidos después de la exposición a 10 mg de nano-Ag/l. Teniendo en cuenta que la disminución de los títulos virales ≥ 2 log puede considerarse como la actividad biológicamente significativa más baja en aplicaciones antimicrobianas y que se requiere una reducción de al menos 4 log en un máximo de 1 h para biocidas en pruebas de suspensión en el marco de la legislación europea64, existe Sólo hay pocas pruebas objetivas de que las nanopartículas de Ag sean antivirales eficaces desde el punto de vista de estos requisitos. Por lo tanto, nuestra conclusión sobre la baja actividad antiviral de nano-Ag en términos de disminución logarítmica de UFP durante una exposición de 1 h (Tabla 2) está en línea con los informes anteriores. Sin embargo, en opinión general, esta conclusión es bastante sorprendente, ya que no demuestra la eficacia antiviral de la nanoplata, contrariamente a la creencia común.

No existe un mecanismo de acción claro propuesto como base de la actividad antiviral de las nanopartículas de CeO2. El análisis elemental de la solución madre en comparación con los datos de la literatura nos permitió excluir la posibilidad de la acción de las nanopartículas de CeO2 a través de iones de Ce liberados65. Se encontró que la concentración de equilibrio de los iones liberados era extremadamente baja (10–7–10–8 M)42,66 y nuestros experimentos con Ce(NO3)3 mostraron que la actividad antiviral de los iones Ce3+ sólo puede evidenciarse en concentraciones varios órdenes superiores. de lo que se puede lograr debido a la disolución de las nanopartículas de CeO2 (Fig. 4).

Como mecanismo diferente de inactivación de virus, se ha informado de la unión de nanopartículas de CeO2 al material genético viral. Link et al.67 demostraron una alta capacidad de unión de nanopartículas de CeO2 a ácidos nucleicos en virus adenoasociados, adenovirus, virus de inmunodeficiencia humana y virus de la leucemia murina67. Sin embargo, la unión de nanopartículas al material genético de los virus sólo podría tener lugar si éste no está protegido por la cápside, por ejemplo durante la replicación. Neal et al.58 propusieron otro modo de unión, quienes sugirieron que las nanopartículas de CeO2 dopadas con Ag pueden interactuar físicamente con la membrana de los virus envueltos, lo que lleva a la alteración de su bicapa lipídica. En el caso de virus sin envoltura, se sugirió una interacción con proteínas del virión.

Como nuestro ensayo antiviral implicó la exposición de viriones completos a nanopartículas antes de la infección celular, analizamos si el nano-CeO2 podría afectar la unión de un virus a su ligando natural. Se realizó un ensayo ELISA para medir la actividad de unión in vitro del nano-CeO2 expuesto al SARS-CoV-2 a su objetivo celular, el receptor ACE2 humano recombinante (Fig. 5). Curiosamente, la exposición del SARS-CoV-2 al nano-CeO2(-) y al nano-CeO2(+) afectó al virus de forma algo diferente. Mientras que la exposición del SARS-CoV-2 a ≥ 200 mg/l de nano-CeO2(-) inhibió la unión del virus a ACE2, la exposición del SARS-CoV-2 a nano-CeO2(+) no tuvo ningún efecto observable. Sin embargo, como los perfiles antivirales de ambas nanopartículas de CeO2 fueron relativamente similares, estos resultados no nos permiten afirmar que la unión a la superficie y el bloqueo de la unión del ligando sean el principal mecanismo de acción antiviral del nano-CeO2 evidenciado por nosotros en ensayos antivirales. Por lo tanto, el modo de acción que impulsa el efecto antiviral de las nanopartículas de CeO2 se aclarará en estudios futuros.

Esquemas del experimento (A), donde la parte superior muestra la unión del SARS-CoV-2 al receptor ACE2 sin nanopartículas y la parte inferior demuestra la inhibición teórica de la unión del SARS-CoV2 al receptor ACE2 mediante nanopartículas de CeO2. (B) Muestra el efecto de nano-CeO2(+) y (C) el efecto de las partículas de nano-CeO2(-) sobre la unión del SARS-CoV-2 al receptor ACE2 en un ensayo ELISA, medido como densidad óptica (OD450) .

Paralelamente a las propiedades antivirales, se analizó la actividad antibacteriana frente a Escherichia coli gramnegativa y Staphylococcus aureus grampositivo. Según nuestros resultados, ni el nano-CeO2(+) ni el nano-CeO2(-) hasta 2000 mg/l disminuyeron los recuentos viables (expresados ​​como unidades formadoras de colonias, UFC) de E. coli o S. aureus en más de 2 logs (99%) (Fig. 6, Tabla 3), lo que indica que el efecto antiviral de las nanopartículas de CeO2 fue más pronunciado que su eficacia bactericida. La comparación de cambios menores que una disminución de 2 log en los niveles de UFC en E. coli y S. aureus mostró que E. coli gramnegativa se vio afectada por nano-CeO2 en mayor medida que S. aureus grampositiva (Tabla 3). Si bien las concentraciones de nano-CeO2(-) de 2, 20 y 200 mg/l disminuyeron el número de UFC de E. coli entre 1,48 y 1,68 logs, no se observó ninguna disminución en los recuentos viables de S. aureus en respuesta al nano-CeO2. Curiosamente, la respuesta de E. coli no fue monótona, al igual que en el caso del bacteriófago sin envoltura MS2. La mayor sensibilidad de las bacterias Gram negativas en comparación con las bacterias Gram positivas contra las partículas de nano-CeO2 también se ha demostrado en estudios anteriores y se ha relacionado con la actividad redox de la nanoceria y la capacidad de una capa de peptidoglicano más gruesa para aliviar este efecto68. En la literatura se pueden encontrar resultados variables sobre los efectos antibacterianos de las nanopartículas de CeO2, tanto debido a la variedad de nanopartículas utilizadas como a los diferentes ensayos antibacterianos aplicados. Se ha demostrado que las concentraciones mínimas inhibidoras (CIM) de nano-CeO2 frente a una serie de bacterias Gram positivas y negativas varían entre 20 y 140 mg/l69,70. Otro estudio en el que se prepararon nanopartículas de CeO2 utilizando el surfactante Tween-80 demostró una CIM de 150 mg/l, mientras que sin el surfactante el valor de CIM era de 3000 mg/l71. En otro estudio, se logró la inactivación completa de E. coli en presencia de 1000 mg/l de nanopartículas de CeO272. Por lo tanto, nuestro resultado que muestra que no hay actividad antibacteriana significativa del CeO2 contra S. aureus Gram-positivo (Tabla 2) y un efecto antibacteriano relativamente modesto contra E. coli Gram-negativo hasta 2000 mg/l, coincidió con algunos de los resultados publicados anteriormente, pero diferían de los demás, respectivamente.

Actividad bactericida tras 1 h de exposición a nano-CeO2, Ce(NO3)3, nanopartículas de SiO2 y Ag frente a Escherichia coli Gram-negativa (A) y Staphylococcus aureus Gram-positiva (B). La actividad bactericida se expresa como una reducción logarítmica en los recuentos viables en comparación con el control no expuesto después de 1 h. Los resultados de tres experimentos independientes con desviación estándar se expresan como reducción de log UFC/ml. La línea de puntos indica un límite de cuantificación.

A diferencia del nano-CeO2, que mostró un efecto antibacteriano significativo o relativamente modesto, las partículas de nano-Ag demostraron un efecto antibacteriano significativo ya a 1,5 mg/l. Como era de esperar, las bacterias Gram negativas eran más sensibles a los nano-Ag y, a 1,5 mg/l, ya se observó una disminución de más de 4 log en los recuentos viables de E. coli. La viabilidad de S. aureus grampositivo disminuyó en > 4 log desde 15 mg de nano-Ag/l (Fig. 6, Tabla 3). Estos resultados concuerdan con estudios anteriores que han demostrado la eficacia de las nanopartículas de Ag a partir de un rango bajo de mg/l27. De hecho, las nanopartículas de plata que actúan mediante la liberación de iones de plata y la formación de ROS73 y la siguiente interacción entre los iones Ag y los grupos tiol de proteínas, así como la permeabilización de la membrana bacteriana, se han considerado generalmente como las nanopartículas con mayor actividad antibacteriana. En enero de 2022, se registraron más de 18.000 artículos en ISI WoS sobre “nano* AND silver* AND antibacter*”.

Las nanopartículas de SiO2, generalmente consideradas inofensivas, no mostraron ninguna toxicidad bacteriana en nuestros experimentos. Otros estudios también han demostrado la inexistente actividad antibacteriana del nano-SiO2 solo; sin embargo, la mayoría de los artículos sobre SiO2 utilizaron nanopartículas de sílice como portadores de iones metálicos biológicamente más activos u otras nanopartículas y, por lo tanto, no son una comparación adecuada para nuestro propósito.

En este estudio analizamos la disminución de la infectividad viral debido a la exposición a nanopartículas de CeO2. Según algunos estudios anteriores, los materiales de CeO2 pueden exhibir una actividad antiviral significativa y al mismo tiempo ser relativamente inofensivos para las células humanas e incluso protegerlas del estrés ambiental. Esto sugiere que las nanopartículas de CeO2 podrían considerarse antivirales prometedores. Nuestro análisis de la actividad de dos tipos de nanopartículas de CeO2 hacia cuatro virus con envoltura demostró una disminución de más de 2 logs (99%) en la infectividad viral después de la exposición a 20-200 mg Ce/l de nano-CeO2 y más de 4 logs (99,99%). ) disminución de la infectividad después de una exposición a 200-2000 mg/l. Se esperaba que los dos virus sin envoltura fueran menos sensibles al nano-CeO2; uno de ellos, el picornavirus EMCV, no mostró ninguna disminución en la infectividad hasta la concentración más alta probada y el otro, el bacteriófago MS2, demostró una ligera disminución no monótona en la infectividad después de la exposición a una de las partículas de CeO2 probadas. Esto nos permite plantear la hipótesis de que las nanopartículas de CeO2 pueden interactuar no sólo con proteínas, sino también con otros componentes de la envoltura viral, por ejemplo, los fosfolípidos, que están ausentes en el caso de los virus sin envoltura.

Curiosamente, incluso si las dos nanopartículas de CeO2 exhibían diferentes propiedades superficiales, una con una carga superficial positiva y la otra con un grupo citrato cargado negativamente en su superficie, su actividad antiviral era relativamente similar. Esto nos permite sugerir que las propiedades intrínsecas de las nanopartículas, más que la carga superficial o los grupos funcionales de la superficie, fueron las responsables de los efectos antivirales observados. Además, nuestros resultados que indican una actividad antiviral relativamente baja de los iones Ce y la toxicidad inexistente de una nanopartícula inerte de SiO2 nos permiten concluir que la actividad antiviral del nano-CeO2 no se debió a la liberación de iones ni a efectos específicos de los materiales nanométricos. En comparación con los virus, las bacterias mostraron una sensibilidad significativamente menor a las nanopartículas de CeO2. La disminución máxima en los recuentos viables de la bacteria Escherichia coli fue solo del 97%, mientras que el efecto antibacteriano no fue monótono. La bacteria Gram positiva Staphylococcus aureus no se vio afectada por el nano-CeO2 en ninguna de las concentraciones analizadas. Es importante destacar que no se observó ningún efecto citotóxico del nano-CeO2. Por otro lado, las nanopartículas de Ag que han sido consideradas antivirales en varios informes anteriores, no mostraron ninguna actividad antiviral significativa en nuestro estudio, a excepción de un bacteriófago sin envoltura ф6. Sin embargo, el nano-Ag demostró ser antibacteriano y redujo el recuento de bacterias viables en más del 99,99 % ya en concentraciones bajas de mg/l. En concentraciones más altas, el nano-Ag también mostró efectos citotóxicos. Por lo tanto, según nuestros resultados, podemos concluir que las nanopartículas de Ag exhiben un efecto biológico relativamente inespecífico, mientras que el nano-CeO2 muestra una actividad antiviral relativamente específica. Sin embargo, se necesita una investigación más detallada para dilucidar el mecanismo de acción antiviral de las nanopartículas de CeO2 y los objetivos específicos de la nanoceria en diferentes virus.

Todos los productos químicos utilizados en el estudio fueron de grado analítico. Los componentes de los medios de crecimiento se describen con más detalle a continuación.

Los materiales objetivo cuyo potencial antiviral se evaluó en este estudio fueron nanopartículas de ceria que se sintetizaron utilizando dos métodos que dieron como resultado nano-CeO2 con potencial zeta de superficie positivo y negativo. Los efectos antivirales del nano-CeO2 se compararon con nanopartículas de sílice (nano-SiO2) que se consideraron biológicamente inertes (control negativo) y nanopartículas de plata (nano-Ag) que se consideraron potencialmente antivirales (control positivo). Para la síntesis de nanopartículas se utilizaron los siguientes productos químicos: nitrato de cerio (III) hexahidrato (99,0%, Sigma-Aldrich), nitrato de diamonio y cerio (IV) (98%, Fluka), hexametilentetramina (HMTA, grado analítico, Sigma-Aldrich) , ácido cítrico (99 %, Fluka), citrato de sodio dihidrato (98 %, Sigma-Aldrich), ortosilicato de tetraetilo (TEOS, 98 %, Fluka), solución acuosa 0,1 M de AgNO3 (Fluka, grado analítico), tetrahidridoborato de sodio (Sigma Aldrich, grado reactivo), alcohol etílico (grado analítico, Sigma-Aldrich), polietilenglicol (PEG, Mw 1500, grado reactivo, Sigma Aldrich), polivinilpirrolidona (PVP, Mw 10000, grado reactivo, Sigma Aldrich), amoniaco acuoso al 30% solución (grado reactivo, Sigma Aldrich). Todas las soluciones se prepararon con agua desionizada MQ.

Para la síntesis de nanopartículas de nano-CeO2(+) se utilizó la técnica modificada de la Ref.74. El nitrato de diamonio y cerio (IV) se hidrolizó a alta temperatura en presencia de HMTA. Para ello, se disolvieron 0,189 g de (NH4)2Ce(NO3)6 y 0,053 g de HMTA en 50 ml de agua y se cargaron en un recipiente de autoclave (100 ml). El recipiente se selló y se calentó a 180 °C durante 30 minutos en el dispositivo hidrotermal de microondas (Berghof Speedwave 4, 2,45 GHz, 1000 W). Después del tratamiento térmico, el recipiente se enfrió hasta temperatura ambiente en un baño de agua. El producto se centrifugó durante 10 min, el sedimento se lavó con agua desionizada y se redispersó mediante ultrasonicación. Estos pasos se repitieron al menos 3 veces y el producto final se redispersó en 5 ml de agua MQ mediante ultrasonidos hasta que se obtuvo un coloide opalescente de color amarillo pálido. Como resultado, se obtuvieron nanopartículas con una superficie casi "desnuda" con carga positiva.

Para la síntesis de nanopartículas de nano-CeO2 (-) utilizamos un método de la Ref.75. El nitrato de cerio (III) se hidrolizó a temperatura ambiente en presencia de amoníaco con oxidación simultánea por oxígeno del aire. Para ello, se disolvieron 0,045 g de ácido cítrico en 25 ml de una solución acuosa 0,05 M de nitrato de cerio (III) preparada previamente. La solución se añadió rápidamente a 100 ml de una solución 3 M de amoníaco y se dejó agitar vigorosamente durante 2 h, durante las cuales el color de la solución cambió de incoloro a amarillo anaranjado. Después de eso, la solución coloide se centrifugó, se lavó y se redispersó mediante ultrasonicación. Estos pasos se repitieron al menos 3 veces y el producto final se redispersó en 15 ml de agua MQ mediante ultrasonidos hasta que se obtuvo un coloide transparente de color amarillo oscuro. Este método permitió la producción de nanopartículas de ceria estabilizadas por iones citrato y, por tanto, con una gran carga negativa.

Para la síntesis de nano-Ag se utilizó una técnica mediada por semillas de dos pasos, adoptada de la Ref.76 y modificada para evitar reactivos tóxicos. Para la preparación de semillas, se mezclaron 20 ml de una solución 2,5 mM de citrato de sodio con 1 ml de una solución acuosa de PVP (PM 10000) a 5 g/l y 1,2 ml de una solución 10 mM de NaBH4 recién preparada. A esta mezcla se le añadieron 20 ml de solución 0,5 mM de nitrato de plata a una velocidad de 2 ml/min con agitación constante. Las semillas de Ag se dejaron formar durante 15 minutos con agitación a temperatura ambiente. En la segunda etapa, se añadieron 27 ml de la solución de semilla preparada a la solución de 0,5884 g de citrato de sodio en 470 ml de agua MQ. Esta mezcla se calentó hasta 85 °C con agitación y cuando se alcanzó esta temperatura, se agregaron a la solución 0,625 ml de solución de AgNO3 0,1 M, que luego se dejó en agitación durante 15 min. Para purificar y concentrar la solución obtenida, se realizó una ultracentrifugación (Beckman Coulter, dispositivo Optima XE-90 Ultracentrifuge, 28.000 rpm/141.000 xg, 2,5 h). Esto nos permitió obtener una solución con una concentración de 0,13 g/ml. A partir de esta solución madre, se prepararon muestras menos concentradas mediante dilución con agua MQ.

La síntesis de nano-SiO2 se llevó a cabo utilizando una técnica de Stöber modificada77. Para ello, se mezclaron 18 ml de agua MQ con 100 ml de etanol. En esta mezcla de agua y alcohol se disolvieron 1,5 g de PEG, 6,2 ml de TEOS y 3 ml de solución de NH4OH. La mezcla de reacción resultante se dejó a temperatura ambiente con agitación vigorosa durante 24 h. Después de eso, el SiO2 sintetizado se centrifugó, se lavó con agua desionizada y se redispersó mediante ultrasonicación. Estos pasos se repitieron al menos 3 veces y el producto final se redispersó en 5 ml de agua MQ mediante ultrasonidos hasta que se obtuvo un coloide incoloro opalescente.

Las características de las nanopartículas, el tamaño, la forma, el estado de aglomeración, la distribución de tamaños, las características de la superficie y la solubilidad, fueron elegidas de acuerdo con la recomendación del Comité Científico de Riesgos para la Salud Emergentes y Recientemente Identificados de la Comisión Europea79. El tamaño y la morfología de las partículas se estudiaron mediante microscopía electrónica de transmisión (FEI Tecnai F20 TEM). Para el análisis TEM, se depositó una gota de suspensión de partículas de 100 mg/l sobre una rejilla de cobre recubierta de carbono con orificios de malla 400 (Agar Scientific AGS147-4) y se secó la muestra. El potencial de agregación de partículas (medición del tamaño hidrodinámico mediante dispersión dinámica de luz, DLS) y las mediciones del potencial zeta de superficie se realizaron utilizando Malvern Zetasizer Nano ZSP a partir de suspensiones acuosas de partículas a la concentración más alta probada en el ensayo antiviral. En el caso del nano-CeO2, todas las concentraciones analizadas en el ensayo antiviral se midieron mediante DLS. Las mediciones de nano-SiO2 y nano-Ag se llevaron a cabo utilizando los correspondientes parámetros preestablecidos del dispositivo; Las mediciones de nano-CeO2 se llevaron a cabo utilizando parámetros preestablecidos para nanopartículas de TiO2 como los más cercanos entre los disponibles. Se utilizó agua como disolvente en estas mediciones para parecerse a las condiciones de exposición reales en ensayos antivirales y bacterianos.

Se midieron características de superficie más detalladas del nano-CeO2 utilizando el modo UV-Vis (250–800 nm) del dispositivo Agilent Cary 5000 UV-Vis-NIR y el modo de análisis espectral FTIR del espectrómetro FTIR Bruker Vertex 70. Para este último se utilizó la configuración ATR con cristal de diamante, y se utilizaron detectores de telururo de mercurio y cadmio y MCT. Los datos se obtuvieron en el rango de 4000 cm-1 a 400 cm-1. La separación de la solución madre para el análisis elemental se realizó mediante ultracentrifugación (Beckman Coulter, dispositivo ultracentrífuga Optima XE-90) de coloides a 300.000 xg durante 2 h. El análisis elemental se realizó utilizando un espectrómetro ICP-MS (Agilent Technologies, 2009).

Antes de las pruebas de actividad antiviral, se evaluaron los efectos de las nanopartículas y otros productos químicos de prueba en los organismos huéspedes de esos virus: líneas celulares en el caso de virus de mamíferos y bacterias en el caso de bacteriófagos.

Se probó la citotoxicidad contra líneas celulares huésped del virus (Tabla 4). Las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se cultivaron en un medio específico (Tabla 1) hasta alcanzar una confluencia del 70%, después de lo cual se eliminó el medio de crecimiento y se agregaron 100 µl del compuesto probado correspondiente al que más tarde se probó para detectar efectos antivirales. Las células se incubaron durante 1 h a 37 °C, 5 % de CO2 y atmósfera humidificada, después de lo cual se eliminó el medio con los compuestos de prueba, se añadió medio de crecimiento fresco y las células se incubaron más durante 48 h. La viabilidad celular se midió usando el reactivo de proliferación celular (WST-1) (Roche) tox al que se agregaron 10 µl/pocillo de reactivo WST-1, la placa se incubó a 37 °C, 5 % de CO2 durante 3 h y se midió la absorbancia a 450 nm. leer. Para el cálculo, se restó el valor de un pocillo en blanco (sin células presentes) de cada medición y el valor de los pocillos sin un compuesto de prueba se consideró como 100 % de viabilidad. Se probaron tres réplicas para cada compuesto y concentración. Las concentraciones de las sustancias de prueba que provocaron toxicidad celular no se probaron para determinar sus efectos antivirales, ya que no se podían evitar las interferencias de la toxicidad celular.

Las bacterias huésped de los dos bacteriófagos (Tabla 4) se expusieron a las sustancias de prueba en formato de ensayo en placa omitiendo el bacteriófago. Se crearon céspedes bacterianos mezclando cultivos nocturnos de Pseudomonas o cultivos de Escherichia coli cultivados exponencialmente con agar blando TSB o NZCYM (Tabla 4), respectivamente, y se vertieron en placas de Petri como se describe a continuación en "Ensayos bactericidas". Se pipetearon gotas de 10 µl de la concentración especificada de sustancias de prueba (véanse los rangos de concentración probados en la Tabla 2) sobre la superficie agarizada. Después de una incubación durante la noche, se observaron zonas de inhibición en el césped bacteriano en las gotas de productos químicos. Ninguna de las nanopartículas o productos químicos, excepto el nano-Ag, dio lugar a zonas de inhibición. Para mitigar la toxicidad de los nano-Ag en ensayos antivirales con bacteriófagos, estas nanopartículas se probaron en combinación con un exceso molar triple de l-cisteína. Por lo tanto, en el caso de 14 μM de nano-Ag se añadió un volumen igual de 42 μM de l-cisteína, en el caso de 140 μM de nano-Ag se añadió un volumen igual de 420 μM de l-cisteína y en el caso de 1400 μM de un volumen igual de nano-Ag. Se añadió l-cisteína Ag 4200 µM. Las concentraciones de l-cisteína hasta 4200 μM no disminuyeron el título de ninguno de los bacteriófagos.

Los seis virus y bacteriófagos utilizados en las pruebas y los medios utilizados para su infección y propagación se describen en la Tabla 4 y a continuación. Las nanopartículas y los productos químicos utilizados para las pruebas antivirales se muestran en la Tabla 2. En general, las suspensiones acuosas de productos químicos en concentraciones específicas se mezclaron con una cantidad igual de bacteriófagos en agua o con virus de mamíferos en un medio de cultivo celular diluido en agua al 1/10. Las muestras se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente, después de lo cual se diluyeron en series de diez veces utilizando tampón SM (bacteriófagos) o medio de crecimiento de virus (virus de mamíferos). Se eligió una incubación de 1 h para seguir los requisitos del Reglamento Europeo de Productos Biocidas para las pruebas de eficacia antimicrobiana de los artículos tratados.

Los virus (Tablas 2, 4) se obtuvieron de las siguientes fuentes: el SARS-CoV-2 fue un aislado estonio local obtenido de la Junta de Salud de Estonia; el virus de la influenza A/WSN/1933 era de SinoBiological; TGEV se obtuvo de L. Enjuanes en el Departamento de Biología Molecular y Celular, Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC), Madrid, España; EMCV se obtuvo del Centro de Investigación de Virus de la Universidad de Glasgow, A. Kohl MRC, Glasgow, Escocia, Reino Unido. Las líneas celulares para la propagación del virus (Tabla 4) procedían de la biblioteca de cultivos celulares del Instituto Tecnológico de la Universidad de Tartu, excepto las células ST obtenidas de L. Enjuanes, Madrid, España. Para la propagación de coronavirus, se infectaron células confluentes Vero E6 (para SARS-CoV-2) o ST (para TGEV) cultivadas en un matraz T75 con reservas virales en VGM con una multiplicidad de infección de 0,01 ufp/célula. Las células infectadas se incubaron durante 4 días a 37 °C, 5% de CO2. Se recogió el sobrenadante celular, se aclaró mediante centrifugación a 3000 xg durante 15 minutos a +4 °C, se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80 °C. Se obtuvo stock de EMCV listo para usar. Para la propagación del virus de la influenza A/WSN/1933, se infectaron células MDCK-2 confluentes cultivadas en un matraz T175 en VGM que contenía TPCK-tripsina a una concentración final de 1 µg/ml. Las células infectadas se incubaron durante 2 días a 37 °C, 5% de CO2. Se recogió el sobrenadante celular, se aclaró mediante centrifugación a 4000 xg durante 10 min a + 4 °C, se filtró a través de un filtro de 0,2 μm, se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80 °C.

Para las pruebas de actividad antiviral, los virus con títulos iniciales en medios de crecimiento de virus (Tabla 4) se diluyeron 1:10 con agua estéril, se mezclaron con el compuesto de prueba o producto químico y se incubaron como se indicó anteriormente. Después de la incubación, las mezclas de virus se diluyeron con medio de crecimiento de virus 10 veces y se usaron 150 µl de la muestra resultante para infectar células huésped 100% confluentes cultivadas en placas de 12 o 96 pocillos y se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS). En experimentos con SARS-CoV-2, se utilizaron 25 µl de la muestra de virus diluida para infectar células Vero E6. Se añadieron 150 µl o 25 µl de medio de crecimiento de virus a las células en control negativo. La infección se llevó a cabo a 37 °C, 5% de CO2, atmósfera humidificada durante 1 h con balanceo suave cada 10 min. Después de 1 h, se eliminó el medio de infección y se añadió una mezcla 3:2 de medio de crecimiento del virus: carboximetilcelulosa (CMC) al 2% (en el caso del virus de la influenza, la mezcla se complementó con 1 µg/ml de TPCK-tripsina). Las células se cultivaron en los respectivos medios de crecimiento durante 96 h (como excepción, 48 h en el caso de EMCV y Vero E6) a 37 °C, 5% de CO2 y atmósfera humidificada. Para el recuento de placas en células ST, MDCK-2 y BHK-21, se eliminó el medio de crecimiento del virus y las placas se tiñeron con cristal violeta. Las placas se identificaron como placas transparentes dentro de la capa celular. En las células Vero E6, se utilizó el método de miniplaca, en el que las placas se fijaron con acetona al 80% helada en PBS 1 × a -20 °C durante 1 h. Luego se eliminó la acetona pipeteando y las placas se secaron durante al menos 3 h. Las placas secas se trataron con un tampón de bloqueo (Thermo Scientific, Ref. 37587) diluido en PBS/Tween20 al 0,05% (PBS-T) durante 60 min a 37 °C. A continuación, las placas se sondaron con el anticuerpo monoclonal de conejo anti-nucleocápside anti-SARS-CoV-2 82C3 (Icosagen AS, ref. nr. R1-166-100) diluido en PBS-T durante 1 hora a 37 °C. Las placas se lavaron 6 x 5 minutos con PBS-T y se trataron con anticuerpo secundario de cabra anti-conejo IRDye800CW (LI-COR Biosciences, ref. nr. 926-32211) diluido en tampón de bloqueo durante 60 minutos a 37 °C. Las placas se lavaron con PBS-T 6 × 5 min, se secaron y escanearon utilizando el sistema de imágenes infrarrojas Odyssey de LI-COR Biosciences y el software de aplicación para identificar focos fluorescentes (miniplacas). Se contaron un mínimo de 3 placas y un máximo de 30 placas por pocillo y se calculó el valor de UFP según la dilución y el volumen del inóculo. Cada concentración de nanopartículas o sal se probó en tres réplicas y se realizaron al menos tres experimentos independientes.

La actividad antiviral se calculó como una diferencia entre los recuentos de unidades formadoras de placa (UFP) transformadas logarítmicamente en el control negativo y la muestra de prueba. La disminución de 2 log en los recuentos de UFP durante 1 h se consideró como el umbral biológicamente significativo más bajo en aplicaciones potenciales.

El bacteriófago con envoltura ф6 (DSM21518) y el MS2 sin envoltura (DSM21428) y sus respectivas bacterias huésped, Pseudomonas sp. (DSM21428) y Escherichia coli (DSM5695) procedían de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ). Los bacteriófagos se propagaron en sus bacterias huésped y se purificaron en los títulos que se muestran en la Tabla 4. Los bacteriófagos en agua se expusieron a compuestos y productos químicos como se indicó anteriormente durante 1 h, después de lo cual se usó tampón SM para diluir los fagos para el ensayo de placa. Para la infección, se dejaron caer 10 µl de muestras de bacteriófagos en círculos de ~ 0,5 cm de ancho sobre placas bacterianas preparadas a partir de un cultivo cultivado durante la noche (Pseudomonas sp.) o un cultivo exponencial cultivado durante 2 h preparado a partir de un cultivo nocturno (Escherichia coli). 125 μl de E. coli o Pseudomonas sp. se mezclaron con 5 ml de medio de agar superior semisólido (agar al 0,7 % en NZCYM o TSB, respectivamente a 40 °C y se vertieron sobre caldo de lisogenia sólido (LB: 10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de NaCl) placas de agar (1,5% de agar) como una capa delgada. 10 μl de fago que se incubó en agua sin compuestos y se dejó caer sobre césped bacteriano para control negativo. Las placas (áreas sin crecimiento visible de la bacteria huésped) dentro de los círculos se Se contaron después de la incubación durante la noche para obtener las unidades formadoras de placa PFU/ml. Se contaron un mínimo de 3 placas por círculo. Cada concentración de nanopartículas o productos químicos se probó con dos réplicas técnicas y se realizaron al menos tres experimentos independientes.

En las pruebas antibacterianas se utilizaron Escherichia coli DSM1576 (ATCC8739) y Staphylococcus aureus (ATCC6538) procedentes de la American Type Culture Collection. Se mezclaron nanopartículas y Ce(NO3)3 en concentraciones específicas con un volumen igual de suspensiones bacterianas en agua. Se prepararon suspensiones bacterianas con 1 × 107 UFC/ml cultivando las bacterias en su medio de crecimiento (LB) y posterior lavado con agua (centrifugación de 5 min, resuspensión en agua y posterior centrifugación). Las bacterias con concentraciones específicas de nanopartículas y productos químicos se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente, después de lo cual las muestras se diluyeron en series de diez veces usando PBS y se colocaron en placas para el recuento de células viables (las colonias se contaron después del crecimiento durante la noche) como en la Ref.78. Se contaron un mínimo de 3 colonias por gota. Cada condición se probó con dos réplicas técnicas y se realizaron al menos tres experimentos. La actividad antibacteriana se calculó como una diferencia entre las unidades formadoras de colonias (UFC) transformadas logarítmicamente en el control negativo y la muestra de prueba.

La unión de partículas de nano-CeO2 a las proteínas de la superficie del virus se analizó utilizando el SARS-CoV-2 y su receptor celular ACE2-hFc recombinante humano. Las placas ELISA Maxisorp (Nunc) se cubrieron con ACE2-hFc (producto P-308-100, Icosagen, Estonia) en PBS a 1 μg/pocillo y se incubaron a + 4 °C durante la noche. La placa se lavó con PBS-T (solución salina tamponada con fosfato con adición de Tween20 al 0,05%) 5 x 5 min, se bloqueó con BSA/PBS al 3% a + 4 °C durante la noche y luego se lavó con PBS-T. Se mezclaron 10 µl de nano-CeO2(+) y (-) en concentraciones variables con 10 µl (5 × 104 UFP, es decir, 5 × 105 UFP/ml) de SARS-CoV-2 recombinante (rescatado de un clon infeccioso construido en el Instituto de Tecnología de la Universidad de Tartu; contiene mutaciones en la proteína S del SARS-CoV-2 de un aislado sudafricano). Las mezclas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. Se diluyeron 4 µl de la mezcla de virus y nanopartículas 25 veces y se transfirieron a la placa recubierta con el receptor hACE2 recombinante. La placa se incubó a 37 °C durante la noche, se fijó con acetona al 80%/PBS helada a -20 °C durante 1 h. Se eliminó la acetona y la placa se secó durante 1 h. Después de eso, se llevó a cabo el bloqueo con BSA/PBS al 3% a + 37 °C durante 1 h. El anticuerpo primario, anticuerpo monoclonal de conejo contra el SARS-CoV2 RBD 72A5 B12 (R1-172-100 Icosagen, Estonia) se diluyó en BSA/PBS-T al 3 % 1:5000 y se colocó en la placa ELISA a +4 °C durante la noche. Luego, la placa se lavó con PBS-T 5 x 5 min y se incubó con anticuerpo secundario, anti-conejo-HRP (conjugado de peroxidasa de rábano picante, LabAS, Tartu, Estonia) diluido 1:10.000 en BSA al 3%/PBS-T a + 37ºC durante 1h. Luego se lavó la placa con PBS-T 5 x 5 min y se agregaron 50 μl/pocillo de sustrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (Bio-Rad); los pocillos se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min. La reacción se detuvo añadiendo 50 µl/pocillo de H2SO4 0,5 M. La absorbancia a 450 nm se cuantificó utilizando un lector de microplacas. Se utilizaron como control negativo los pocillos no tratados con hACE2.

Se utilizaron datos transformados logarítmicamente para el análisis de los recuentos de UFP o UFC. El análisis ANOVA bidireccional seguido de la prueba post-hoc de Dunnett para detectar diferencias significativas con respecto al control y corregido para comparaciones múltiples con un nivel de significancia de 0,05 se ejecutó en GraphPad Prism 9.3.0. En la Tabla 3 sólo se marcan diferencias estadísticamente significativas.

Los datos originales están disponibles previa solicitud al autor correspondiente: [email protected].

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Los autores agradecen el apoyo financiero de las subvenciones del Consejo de Investigación de Estonia (COVSG2, PRG629, PRG1496), el proyecto del Centro de Excelencia en Investigación de Estonia “Materiales avanzados y dispositivos de alta tecnología para energía, sensorica y nanoelectrónica sostenibles” TK141 (2014-2020.4. 15.01-0011) y Fondo de Desarrollo de la Universidad de Tartu (PLTFYARENG53). La investigación se llevó a cabo en parte utilizando la instalación central de NAMUR+ financiada por los proyectos “Centro de tecnologías e investigación de nanomateriales” (2014-2020.4.01.16-0123) y TT13.

Estos autores contribuyeron igualmente: Alexandra Nefedova y Kai Rausalu.

Instituto de Física, Universidad de Tartu, W. Ostwald Street 1, 50411, Tartu, Estonia

Alexandra Nefedova, Alexander Vanetsev, Stevin Lilla, Meeri Visnapuu, Vambola Kisand y Tanel Tätte

Instituto de Tecnología, Universidad de Tartu, Nooruse Street 1, 50411, Tartu, Estonia

Kai Rausalu y Eva Zusinaite

Instituto de Biología Molecular y Celular, Universidad de Tartu, 23 Riia Street, 51010, Tartu, Estonia

Merilin Rosenberg, Kairi Koppel y Angela Ivask

Departamento de Química y Biotecnología, Universidad Tecnológica de Tallin, Akadeemia Street 15, 12618, Tallin, Estonia

marilyn rosenberg

Instituto de Física del Estado Sólido, Universidad de Letonia, 8 Kengaraga Street, Riga, 1063, Letonia

Krisjanis Smits

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AI fue responsable de asegurar la financiación, diseñar el estudio y escribir el manuscrito, AN fue responsable de la síntesis y caracterización de nanopartículas, el análisis DLS, la redacción y edición del manuscrito, KR fue responsable de la mayoría de las pruebas antivirales y ensayos de citotoxicidad, así como de la edición. del manuscrito, EZ fue responsable de las pruebas antivirales con ensayos de SARS-CoV-2 y ELISA, así como de escribir y editar el manuscrito, AV fue responsable de la síntesis y caracterización de nanopartículas y de escribir el manuscrito, MR fue responsable de diseñar ensayos de bacteriófagos, llevó a cabo realizó pruebas antibacterianas y realizó análisis estadísticos de los datos, KK realizó pruebas con bacteriófagos y analizó los datos, SL participó en la síntesis de nanopartículas y escribió el manuscrito, MV fue responsable del análisis de nanopartículas, incluidas imágenes EM y análisis elemental, KS realizó EM de alta resolución , VK y TT participaron en la edición del manuscrito.

Correspondencia a Angela Ivask.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Nefedova, A., Rausalu, K., Zusinaite, E. et al. Eficacia antiviral de las nanopartículas de óxido de cerio. Informe científico 12, 18746 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-23465-6

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Recibido: 17 de mayo de 2022

Aceptado: 31 de octubre de 2022

Publicado: 05 de noviembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-23465-6

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